分枝杆菌的富集和选择性培养制造技术

本发明专利技术涉及一种富集和选择性培养生物学样品中包含的分枝杆菌的方法，其中将全部或部分所述样品接种于包含适于分枝杆菌发展和生长的营养成分的培养基之中/之上，特征在于所述培养基包含作为选择剂的至少9

【技术实现步骤摘要】
分枝杆菌的富集和选择性培养
[0001]本申请是2016年02月04日提交的题为“分枝杆菌的富集和选择性培养”的中国专利申请201680008539.9的分案申请。
[0002]本专利技术涉及培养和分离分枝杆菌的方法。更特别地，本专利技术涉及可用于检测、鉴别、分离和/或分析性研究分枝杆菌、例如存在于生物学标本和样品中的那些分枝杆菌的微生物学方法和培养基。
[0003]分枝杆菌属于放线菌目(Actinomycetales)，是直线或者有时略为弯曲形状的细小杆菌。由于其具有脂质富集的细胞壁限制染料渗透，因此难以通过常规技术和染料对分枝杆菌染色。然而，一旦染色，所述分枝杆菌的染色可以抵挡酸和醇二者的脱色。为此，其被描述为“酸
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醇抗性”细菌。
[0004]根据一种基本分类法，根据两种主要类别列出不同的分枝杆菌种。
[0005]第一个类别是归并了严格病原性分枝杆菌，其寄生感染动物和人类。这些分枝杆菌是造成结核(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)和卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canetti))或者麻风病(麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))的原因。
[0006]第二个类别归并了腐生或共生分枝杆菌，其通常是非致病性的。由此使用的术语是“非典型”分枝杆菌或者“非结核性”分枝杆菌(NTM)。后者普遍存在于我们的环境中，发现其散播于土壤、植物、灰尘、水和分配网络、食物等中无处不在。一些非结核性分枝杆菌通常对人类无害，而在免疫抑制对象中可以导致机会性感染，主要影响肺、皮肤和淋巴系统。
[0007]因此，从临床观点及也从卫生观点出发，无论其是否是病原性或者非结核性的，分枝杆菌的检测和/或鉴别是相当重要的。早期及特异性检测这些细菌使得可以提出关于治疗性处理、卫生消毒等的合适方案。就此而言存在各种技术，例如基因扩增(通过PCR)特定的核酸序列、抗原的免疫检测、质谱分析、微生物检测酶活性等。
[0008]无论其是什么，这些检测/鉴别方法通常需要培养待分析样品/标本中可能存在的分枝杆菌，以获得适于检测其的量。无论其是什么，这些检测/鉴别方法具有相同的障碍：分枝杆菌生长(croissance)和发展(d
é
veloppement)缓慢。
[0009]事实上，与其它细菌、酵母和真菌相比，病原性和腐生性分枝杆菌特征均在于相对缓慢的生长和发展。此外，在存在待研究的分枝杆菌的生物学样品中，所述分枝杆菌很少被分离；其通常污染有生长和发展快得多的伴随菌群。由于细胞分裂周期进展，样品中分枝杆菌的比例降低，由此增加了能观测和鉴别其的难度。
[0010]为了克服这种生长和发展缓慢和/或其污染其它微生物的问题，已经开发了对于分枝杆菌或者对于分枝杆菌特定种具有或多或少选择性的许多富集培养基和肉汤。
[0011]在最常用的这些中，
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Jensen培养基是凝聚的(非琼脂)培养基，包含基于全蛋、马铃薯淀粉、天冬酰胺、甘油和矿物质的营养成分。这种培养基还含有孔雀石绿，以抑制伴随菌群(特别是革兰氏阴性细菌)。也提议加入青霉素和/或萘啶酸以增加其对于分枝杆菌的选择性。
[0012]相似组成的Coletsos琼脂培养基另外含有丙酮酸和谷氨酸、向日葵蓝(bleu de tournesol)和明胶。
[0013]最近出现的Middlebrook 7H9、7H10和7H11培养基是半合成培养基，其具有基于氨基酸、脂肪酸、丙酮酸和矿物质盐的营养成分。这些培养基还含有过氧化氢酶和牛白蛋白(级分V)，其为分枝杆菌提供对抗可能存在于生物学样品和标本中的各种有害物质(特别是毒性过氧化物)的保护作用。Middlebrook 7H10培养基存在孔雀石绿而与Middlebrook 7H9培养基不同。Middlebrook 7H11培养基与Middlebrook 7H10培养基不同在于其富集胰腺酪蛋白胨。也设计了这三种Middlebrook培养基的许多变化方式以增加其对于分枝杆菌的选择性，例如向其中加入如下选择剂：多粘菌素、两性霉素B、萘啶酸、甲氧苄啶、阿洛西林和万古霉素。
[0014]最后，最初为了培养和检测洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacian)而开发的BCSA(洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)选择性琼脂)培养基已经被描述为特别适于分枝杆菌的发展与生长，更特别是“快速生长”分枝杆菌(Esther et al.
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Journal of Clinical Microbiology；2011,1421
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1425)。这是从包含酪蛋白胨、糖(乳糖和蔗糖)、酵母提取物和选择剂如庆大霉素、万古霉素、结晶紫和多粘菌素B的营养成分配制的琼脂培养基。
[0015]本专利技术旨在改良用于检测、鉴别和/或分离生物学样品中存在的分枝杆菌的方法和技术。为此，本专利技术旨在改良用于这些方法和技术中的富集肉汤和培养基的繁殖力及其对于分枝杆菌的选择性这两个方面。同样，本专利技术旨在提供新的富集肉汤和/培养基成分，能允许分枝杆菌的培养和增殖，且在繁殖力和/或对于分枝杆菌的选择性方面具有改良的性能水平。
[0016]在陈述本专利技术之前，给出如下定义以更好地理解本专利技术。
[0017]术语“培养基”是指包含新陈代谢的表达和/或微生物生长所需的所有元素的基质。培养基可以是固体、半固体或者液体。术语“固体基质”是指例如胶凝的基质或者凝固的基质。琼脂在培养微生物的微生物学中是常规的胶凝剂，但是也可以是使用明胶、琼脂糖或者其它天然或人工胶凝剂。
[0018]术语“富集肉汤”更特别是指液体培养基。
[0019]当培养基成分仅包含被培养的微生物的生长和增殖严格要求的化学元素时，该培养基被描述为基本培养基。如下是在其中常见的：
[0020]‑
水(通常是蒸馏水或者去离子水)；
[0021]‑
营养成分，通常包含：
[0022]‑
基于碳的能量来源(通常是葡萄糖)；
[0023]‑
钙源(例如CaCl2)；
[0024]‑
氮源(例如(NH4)2SO4)；
[0025]‑
硫源(例如(NH4)2SO4)；
[0026]‑
镁源(例如MgCl2)；
[0027]‑
铁源(例如柠檬酸铁)；
[0028]‑
微量元素来源(例如Cu、Zn、Co、Ni、B、Ti的盐)；
[0029]‑
任选将培养基维持在合适pH的pH缓冲剂；及
[0030]对于固体或半固体培养基而言任选存在的胶凝剂(例如琼脂、明胶或琼脂糖)。
[0031]加入特定生长因子和/或不同营养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养基，其包含：
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适于分枝杆菌发展和生长的营养成分，
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作为选择剂的9
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氯
‑9‑
(4
’‑
二乙氨基)苯基
‑
9,10
‑
二氢
‑
10
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苯基吖啶氢氯化物；其中所述营养成分再现选自如下的培养基的营养成分：
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Middlebrook培养基，
‑
培养基，
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Columbia培养基，
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BCSA培养基；以及9
‑
氯
‑9‑
(4
’‑
二乙氨基)苯基
‑
9,10
‑
二氢
‑
10
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苯基吖啶氢氯化物在所述培养基中存在的浓度为8mg/l
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128mg/l。2.权利要求1的培养基，特征在于所述培养基还包含能抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的物质，选自：甲磺酸多粘菌素E、磷霉素、萘啶酸、氨曲南、头孢磺啶和mangrolide A。3.权利要求1的培养基，特征在于所述培养基还包含能抑制洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacian)的物质，选自磷霉素、氨曲南和mangrolide A。4.权利要求1的培养基，特征在于所述培养基还包含至少一种选自两性霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：