引物、试剂盒及其在快速检测黄曲霉素产毒菌中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种引物、试剂盒及其在快速检测黄曲霉素产毒菌中的应用，该引物包括上游引物和下游引物，其中，上游引物的核苷酸序列为：5'

【技术实现步骤摘要】
引物、试剂盒及其在快速检测黄曲霉素产毒菌中的应用


[0001]本专利技术属于黄曲霉素产毒真菌检测
，具体涉及一种引物、试剂盒及其在快速检测黄曲霉素产毒菌中的应用。

技术介绍

[0002]除了重金属、有害元素、农药残留以外，黄曲霉素污染已经成为食品安全的主要威胁。黄曲霉素的毒性和致癌力极高，比砒霜、氰化钾、三聚氰胺的毒性分别高出68倍、10倍、416倍，其致癌力分别是二甲基亚硝胺、奶油黄的75倍、900倍，诱发肝癌能力是苯并芘的4000倍，世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构(IARC)于1993年将黄曲霉毒素划分为Ⅰ类致癌物。2020年版《中国药典》将黄曲霉素指标纳入19种中药材的质量控制内容中，其中大枣、薏苡仁、胖大海、桃仁等10种中药为药食同源药材，既可作为中药材又可作为食品服用，说明加强黄曲霉素的监测已经成为保证食品和中药安全性的重要内容。
[0003]黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)是2种主要的黄曲霉毒素产生菌，有报道米曲霉(A.oryzae)也可产生黄曲霉素；此类真菌在自然界中的分布极为广泛，湿热的环境、不适当储存方式均可导致；黄曲霉毒素有良好的热稳定性，熔点为200
‑
300℃，常规的烹饪、高压灭菌、有机溶剂、强酸等都不能使黄曲霉毒素降解，也就是说黄曲霉素一旦产生，就很难被消除。
[0004]由于一旦食品被黄曲霉素产毒真菌污染，即存在极大的安全风险，因此对源头的准确鉴定是防控黄曲霉素污染的关键。过去对产黄曲霉毒素真菌的检测通常采用形态学方法、免疫学方法等传统检测方法，这些方法主要基于真菌形态、生理特征、抗原特异性等特征进行分类鉴别，通常需要经过纯化培养、形态观察、生理生化鉴定等过程，存在检测周期长、操作程序繁琐、专业知识要求高、鉴别水平不够准确等缺点。现在发展起来的免疫分析和高效液相色谱
‑
质谱联用技术可以准确对黄曲霉素进行定量鉴定，但是存在试剂昂贵、操作复杂、需要样本量大、难以进行菌株品种溯源等缺点。
[0005]为解决上述问题，公告号为CN106318938B的中国专利技术专利公开了一种产黄曲霉毒素真菌的单重PCR检测用引物对组合、检测方法及用途，其中，该单重PCR检测用引物对组合由特异性针对真菌内部转录间隔区序列ITS的ITS引物对、特异性针对产黄曲霉毒素调节基因aflR的aflR引物对、特异性针对柄曲霉素转甲氧基酶基因omt
‑
1的omt
‑
1引物对及特异性针对杂色曲霉素A脱氢酶基因ver
‑
1的ver
‑
1引物对组成。
[0006]该引物对组合虽然能够快速地检测产黄曲霉毒素真菌，但仍存在以下不足：(1)需要四对引物组合使用，只有检测样品中ITS、aflR、omt
‑
1和ver
‑
1四个基因扩增片段均没有检出时才能判定为阳性；(2)灵敏度偏低。

技术实现思路

[0007]本专利技术的专利技术目的是提供一种引物、试剂盒及其在快速检测黄曲霉素产毒菌中的应用，该引物灵敏度高。
[0008]为达到上述专利技术目的，本专利技术的技术方案为：
[0009]一种引物，包括：
[0010]上游引物：5'
‑
CGGGATAGCTGTACGAGTTG
‑
3'；
[0011]下游引物：5'
‑
GTATGAGCATGAGGCGTTGA
‑
3'。
[0012]本专利技术针对黄曲霉、寄生曲霉、米曲霉的AflR基因序列设计了上述引物，该引物不仅能够特异性地扩增黄曲霉、寄生曲霉、米曲霉中AflR基因的保守区片段，而且检测灵敏度高，当采用常规PCR进行检测时，其检测下限为2.0
×
10
‑1ng/μL，当采用实时荧光定量PCR进行检测时，其检测下限为2.0
×
10
‑3ng/μL。
[0013]基于此，本专利技术还提供了上述引物在快速检测黄曲霉素产毒菌中的应用；以及一种用于快速检测黄曲霉素产毒菌的试剂盒，该试剂盒中即含有所述的引物。
[0014]本专利技术的试剂盒可以是常规PCR试剂盒，也可以是实时荧光定量PCR试剂盒。
[0015]当采用常规PCR试剂盒时，该检测方法可以包括以下步骤：
[0016](1)提取待测样品的总DNA，作为模板DNA；
[0017](2)采用如权利要求4所述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的试剂盒对所述的模板DNA进行常规PCR扩增；
[0018]其中，PCR体系为：10
×
Ex Taq Buffer(Mg
2+
free)5μL，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 4μL，浓度为25mM的MgCl
2 4μL，引物各2μL，模板DNA 1μL，Ex Taq 0.5μL，灭菌水补足至50μL；
[0019]PCR扩增程序为：94℃预变性5min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
[0020](3)对扩增产物进行检测，并根据检测结果判断待测样品中是否含有黄曲霉素产毒菌。
[0021]当采用实时荧光定量PCR试剂盒时，该检测方法可以包括以下步骤：
[0022](1)提取待测样品的总DNA，作为模板DNA；
[0023](2)采用如权利要求7所述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的试剂盒对所述的模板DNA进行荧光定量PCR扩增；
[0024]其中，PCR体系为：2
×
SYBR Abstart Master Mix 15μL，浓度为100nmol/L的引物各1μL，浓度为20ng/μL的模板DNA 1.5μL，灭菌水补足至25μL；
[0025]PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；
[0026](3)对扩增产物进行检测，并根据检测结果判断待测样品中是否含有黄曲霉素产毒菌。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0028]本专利技术采用一对特异性扩增AflR基因保守区片段的引物即可实现对黄曲霉素产毒菌(包括黄曲霉、寄生曲霉、米曲霉)的快速准确检测，并且检测灵敏度高，当采用常规PCR进行检测时，其检测下限为2.0
×
10
‑1ng/μL，当采用实时荧光定量PCR进行检测时，其检测下限为2.0
×
10
‑3ng/μL。
附图说明
[0029]图1为本专利技术用于快速检测黄曲霉素产毒菌的引物对12种受测菌株的常规PCR扩增结果图；
[0030]其中，Marker为标准，N为阴性对照；下同；
[0031]图2为本专利技术用于快速检测黄曲霉素产毒菌的引物的常规PCR灵敏度测试结果图；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物，其特征在于，包括：上游引物：5'
‑
CGGGATAGCTGTACGAGTTG
‑
3'；下游引物：5'
‑
GTATGAGCATGAGGCGTTGA
‑
3'。2.如权利要求1所述的引物在快速检测黄曲霉素产毒菌中的应用。3.一种用于快速检测黄曲霉素产毒菌的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的引物。4.如权利要求3所述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的试剂盒，其特征在于，为常规PCR试剂盒。5.快速检测黄曲霉素产毒菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样品的总DNA，作为模板DNA；(2)采用如权利要求4所述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的试剂盒对所述的模板DNA进行常规PCR扩增；(3)对扩增产物进行检测，并根据检测结果判断待测样品中是否含有黄曲霉素产毒菌。6.如权利要求5所述的快速检测黄曲霉素产毒菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR体系为：10
×
Ex Taq Buffer(Mg
2+
free)5μL，浓度为2.5mM的dNTP Mixture 4μL，浓度为25mM的MgCl
2 4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓芹，雷后兴，毛佳乐，刘爽，方蓓倩，袁宙新，
申请(专利权)人：丽水市中医院，
类型：发明
国别省市：