本发明专利技术涉及微生物技术技术领域，具体公开了一种牛樟芝共生真菌AcEF007及其分离方法，所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体的保藏编号为CCTCC NO:M 20211093，本发明专利技术所保护的樟芝共生真菌AcEF007，通过分离筛选牛樟芝的共生菌而得到。通过抗菌活性实验发现，AcEF007菌液体提取物对肺炎克雷伯菌、铜尿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等细菌具有较好的抗细菌活性，本发明专利技术对多种致病细菌有较好的抑制作用，为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
【技术实现步骤摘要】
牛樟芝共生真菌AcEF007及其分离方法
[0001]本专利技术涉及微生物技术
，具体涉及一种牛樟芝共生真菌AcEF007 及其分离方法。
技术介绍
[0002]目前从天然产物中筛选生物活性成分或药物先导化合物是研究创制新药的有效途径之一，微生物是新的天然产物的重要来源，其次生代谢产物是通过多种生物合成和代谢途径而形成。植物内生菌一类侵入植物组织内部生长，但不给宿主造成明显负效应的微生物，在长期共进化过程中，共生菌与宿主植物形成了特殊的生理代谢途径，产生出各种结构的活性化合物，可以帮助宿主增强对昆虫，疾病，干旱，植物病原菌等的抵抗能力，因此研究共生菌的次生代谢产物，对我们开发新的抗菌药物有重要的作用。
[0003]通过长期的自然演变，病原微生物与各物种之间建立了复杂的拮抗或共生关系，不仅能引起某些特定疾病，还可作为条件致病菌，在宿主免疫力低下、机体屏障功能被破坏时发生菌群失调或细菌移位，造成机体的严重感染。为了杀死病菌或者抑制病菌活性，人们专利技术了抗生素和合成抗菌药物，随着抗菌药物的广泛应用，致病细菌对抗生素产生耐药性，甚至出现了多重耐药性，致病菌耐药性的发生和蔓延已构成对人类健康的严重威胁。基于市场和研究的需要，寻找抗菌活性强、可高效利用的新生物资源成为研究的重点。
[0004]已有研究表明在植物内生真菌代谢产物中常发现与其宿主植物活性成分相似或相同的活性物质，其中部分物质为抗菌类物质，在苦楝、丹参、铁皮石斛、元宝草等多种植物共生菌中发现了具有抗细菌、抗氧化、抗真菌等的天然活性物质。牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是台湾特有珍稀药用真菌，寄生在野生牛樟 (Cinnamomum kanehirai)腐朽的树干心材内壁或倒伏的树干潮湿表面，含萜类、多糖、固醇类及脂肪酸等多种生理活性物质，其有效成分具有抗癌、消炎等作用。
[0005]通过研究并分离得到具体的活性菌种，有利于医药产业的进一步发展。
技术实现思路
[0006]本专利技术的主要目的是提供一种牛樟芝共生真菌AcEF007及其分离方法，通过本专利技术获得的牛樟芝共生真菌AcEF007及其培养物或加工物，具有广泛的抗菌、消炎效果，为研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
[0007]为达到以上目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]牛樟芝共生真菌AcEF007，所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0009]进一步地，牛樟芝共生真菌AcEF007(phoma.sp)的保藏编号为CCTCC NO:M20211093，保藏名称为茎点霉属phoma.sp；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；该培养物于2021年8月27日由该保藏中心收到，并登记入册，该培养物的存活性由保藏中心于2021年9月11日检测，且测定结果为存活。
[0010]进一步的，本专利技术提供了一种分离牛樟芝共生真菌AcEF007的方法，包括以下步骤：
[0011](1)先用自来水冲洗牛樟芝子实体36h，然后转入无菌工作台，再用3L无菌水冲洗清子实体；
[0012](2)用灭菌小刀取子实体，放入离心管中，加入超纯水，然后在细胞破碎匀浆机中震荡破碎，将破碎液按十分之一、百分之一、千分之一、万分之一进行稀释，取稀释后的子实体悬浮液涂抹在MYKAS抗细菌培养基上，将接好的培养基放置于26℃恒温培养箱中培养；
[0013](3)待培养基中长出的菌丝，在显微镜下把长出的菌丝转接的到MY培养基上培养，持续观察10d后，将所挑取的菌株进行后续分子鉴定后得到牛樟芝共生真菌AcEF007。
[0014]进一步地，本专利技术提供了制备AcEF007的发酵液提取物方法，包括以下步骤：
[0015](1)加入1000ul的PG液体到2ml的离心管中，并在每个离心管放3颗灭菌好的钢珠，然后将已长成型的牛樟芝共生真菌AcEF007菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90S，然后将破碎液分别接种500ul到每个装有PG液体培养基的锥形瓶中，置于28℃，转速为150r
·
min
‑1的摇床中培养8d；
[0016](2)培养物菌丝体提取，发酵培养完成后，得到牛樟芝共生真菌AcEF007菌丝体及培养液，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中加入乙酸乙酯摇匀 6min，超声30min后静置12h，将分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，获得牛樟芝共生真菌AcEF007培养的发酵液提取物。
[0017]优选的，所述步骤(2)中，于菌液中按照体积比1:1加入乙酸乙酯。
[0018]优选的，所述PG液体培养基包括如下组分：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B
1 0.1g/L。
[0019]本专利技术利用牛樟芝筛选技术方案，分离筛选牛樟芝的共生菌，并对其进行抗菌活性检测，获取菌丝体所产生的抗菌活性化合物，得到一株具有抗菌活性的真菌AcEF007。通过抗菌活性实验发现，AcEF007菌液体提取物对肺炎克雷伯菌、铜尿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等细菌具有较好的抗细菌活性，本专利技术对多种致病细菌有较好的抑制作用，为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
[0020]本专利技术获得的真菌AcEF007在MY培养基上生长良好，菌落表面呈绒毛状，生长前期菌丝是白色呈放射状向周围生长，生长后期菌丝较密集，且菌层较厚，颜色微微泛红，菌落呈规则的圆形状，具有特殊的生物性状，现有的同种群菌未发现与本专利技术具有同样性状的，该菌具有优越的抑菌性能。
附图说明
[0021]图1为本专利技术所述的AcEF007菌丝生长情况图；
[0022]图2为本专利技术AcEF007荧光显微镜下菌丝体图；
[0023]图3为本专利技术的AcEF007对肺炎克雷伯菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组， d表示实验组；
[0024]图4为本专利技术的AcEF007对铜尿假单胞菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组， d表示实验组；
[0025]图5为本专利技术的AcEF007对金黄色葡萄球菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d表示实验组；
[0026]图6为本专利技术的AcEF007对大肠埃希菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d 表示实验组；
[0027]图7为本专利技术的AcEF007对鲍曼不动杆菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组， d表示实验组；
[0028]图8为本专利技术的AcEF007对溶血性葡萄球菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d表示实验组；
[0029]图9本专利技术基于ITS构建了牛樟芝共生真菌AcEF007的系统发育树显示图。
具体实施方式
[0030]下面本专利技术结合附图和具体实施例作进一步说明，本专利技术中使用的化学物均为分析纯级本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.牛樟芝共生真菌AcEF007，其特征在于，所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的牛樟芝共生真菌AcEF007，其特征在于，所述共生真菌AcEF007(phoma.sp)的保藏编号为CCTCC NO:M 20211093。3.根据权利要求1或2所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的培养物或其加工物。4.一种根据权利要求1或2所述的牛樟芝共生真菌AcEF007在制备抗细菌药物中的应用。5.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求3所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的培养物或其加工物。6.根据权利要求5所述的一种菌剂，其特征在于，其活性成分包括如下(a)(b)(c)中的至少一种：(a)牛樟芝共生真菌AcEF007的发酵液提取物；(b)牛樟芝共生真菌AcEF007细胞的超声裂解上清；(c)牛樟芝共生真菌AcEF007细胞的超声裂解沉淀。7.一种分离权利要求1或2所述的牛樟芝共生真菌AcEF007的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)先用自来水冲洗牛樟芝子实体36h，然后转入无菌工作台，再用3L无菌水冲洗清子实体；(2)用灭菌小刀取子实体，放入离心管中，加入超纯水，然后在细胞破碎匀浆机中震荡破碎，将破碎液进行稀释，取稀释后的子实体悬浮液涂抹在MYKAS抗细菌培养基上，将接好的培养基放置于26℃恒温培养箱中培养；(3)待培养基中长出的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，郑元，杨宇明，
申请(专利权)人：郑元，
类型：发明
国别省市：
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