用于结核疫苗的融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及基于结核分枝杆菌抗原多肽的融合蛋白，用于预防、抑制或治疗由结核复合物物种引起的感染和/或疾病。具体而言，本发明专利技术涉及包含不引发针对BCG的免疫应答的抗原和/或ESAT

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于结核疫苗的融合蛋白


[0001]本专利技术涉及基于结核分枝杆菌抗原多肽的融合蛋白，用于预防、抑制或治疗由结核复合物物种引起的感染和/或疾病。具体而言，本专利技术涉及包含不引发针对BCG和/或ESAT
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6重复的免疫应答的抗原的融合蛋白。融合蛋白可包含早期和晚期抗原的组合。此外，本专利技术涉及包含融合蛋白的疫苗、免疫原性组合物和药物组合物。

技术介绍

[0002]据世界卫生组织(WHO)称，由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)引起的人类结核病是一个严重的全球健康问题，每年造成数百万人死亡。20世纪60和70年代，新发肺结核病例呈下降趋势，但这一积极趋势已被打破，部分原因是艾滋病(AIDS)的出现和结核分枝杆菌的耐多药菌株的出现。
[0003]目前可用于临床的唯一疫苗是BCG(卡介苗)，这种疫苗的效力仍有争议。BCG是一种减毒活疫苗，在大多数结核病流行地区广泛用于婴儿。BCG通常会在结核病动物模型中诱导高水平的获得性耐药性，并且在儿童中它可以预防传播形式的结核病，例如脑膜炎和粟粒性结核病。当给幼儿服用时，它可以预防结核病多年，但随后疗效下降。各种对照试验的比较表明，卡介苗对成人的保护功效差异很大，功效范围从无效到80％保护。这使得针对结核分枝杆菌的新型改良疫苗的开发成为当务之急，WHO已将其列为高度优先事项。
[0004]目前，有几种新的结核疫苗处于临床试验阶段。由于普遍认为需要强大的细胞免疫应答来预防结核感染和疾病，因此目前大多数临床结核病候选疫苗旨在从CD4+或CD8+T细胞诱导经典的TH1细胞因子，如IFN
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γ或TNF
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α，而没有解决关于提高T细胞质量的问题，T细胞质量在保护性免疫中起着重要作用。目前的结核病候选疫苗包括各种疫苗平台，例如灭活的全细胞或全细胞提取物、基于病毒载体的疫苗、活的重组BCG或减毒BCG疫苗，以及DNA疫苗。然而，到目前为止，上述疫苗平台都没有产生令人信服的临床结果。
[0005]提供有效结核疫苗的替代策略围绕着基于结核分枝杆菌抗原融合蛋白的亚单位疫苗展开。亚单位方法已被认为具有许多优点，例如提高的安全性和稳定性以及增强先前BCG疫苗接种的能力。人们已经努力将多种结核分枝杆菌抗原的融合蛋白与适宜的佐剂结合以诱导强大的细胞免疫应答。
[0006]WO2010006607A2中证明了当与佐剂IC31一起施用时，仅由两种结核分枝杆菌抗原组成的简单融合物可起到结核疫苗的作用。WO2006136162A2、WO2014063704A2和WO2015161853A1都公开了抗结核感染和疾病的融合蛋白，其中多种结核分枝杆菌抗原被混合以提供能够诱导强免疫应答的亚单位疫苗。然而，上述融合蛋白的共同点是，目前还没有一种相应的亚单位疫苗形成商业上可用的抗结核疫苗。
[0007]因此，改进的结核疫苗具有产生临床上可接受疫苗的潜力，将是有利的。特别地，能够诱导强的高质量免疫应答从而有增强保护能力的融合蛋白将是有利的。

技术实现思路

[0008]本文提供了融合蛋白，其在概念上不同于先前开发的用于预防、抑制或治疗结核感染和/或疾病的融合蛋白。本文所述的融合蛋白是基于不引发针对BCG的免疫应答的抗原(本文称为“BCG
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抗原”)和/或“ESAT
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6重复”，其中融合蛋白中存在一个以上ESAT
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6抗原拷贝。融合蛋白可包含早期和晚期抗原的组合。与现有结核疫苗相比，本文提供的融合蛋白产生改善的免疫应答。
[0009]因此，本专利技术的一个目的涉及提供包含BCG
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抗原和/或ESAT
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6重复的融合蛋白，其诱导强的细胞免疫应答，同时改善T细胞的质量。
[0010]本专利技术的另一个目的涉及提供包含早期和晚期结核抗原组合的融合蛋白，其既能加速Mtb感染后的免疫应答，又能在感染的晚期慢性阶段诱导具有特异性识别细菌潜力的T细胞。
[0011]本专利技术的另一个目的是提供融合蛋白，其可作为独立疫苗或与BCG组合，有效地用在疫苗或免疫原性组合物中以预防、抑制或治疗结核感染和/或疾病。
[0012]因此，本专利技术的一个方面涉及一种包含至少五种源自结核分枝杆菌的抗原的融合蛋白。
[0013]本专利技术的一种实施方式涉及如本文所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含早期和晚期抗原。
[0014]本专利技术的另一种实施方式涉及如本文所述的融合蛋白，其中所述抗原从BCG中缺失、不分泌或具有低表达。
[0015]本专利技术的另一种实施方式涉及如本文所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少两个ESAT
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6重复，例如至少三个ESAT
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6重复，例如至少四个ESAT
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6重复，例如至少五个ESAT
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6重复。
[0016]本专利技术的另一方面涉及包含如本文所述的融合蛋白的疫苗或免疫原性组合物。
[0017]本专利技术的另一方面是提供本文所述的融合蛋白或本文所述的疫苗或免疫原性组合物，用于针对由毒性分枝杆菌引起的感染和/或疾病，对受试者进行疫苗接种或免疫。
[0018]本专利技术的另一方面是提供一种试剂盒，包括：
[0019]i)如本文所述的融合蛋白或如本文所述的疫苗或免疫原性组合物，
[0020]ii)BCG，以及
[0021]iii)可选地，使用说明。
[0022]本专利技术的另一方面是提供一种核酸序列，其包含编码如本文所述的融合蛋白的序列。
[0023]本专利技术的另一方面是提供一种重组表达载体，其包含如本文所述的核苷酸序列可操作地连接至一个或多个适于指导在适宜宿主中产生融合蛋白的控制序列。
[0024]本专利技术的另一方面是提供一种重组宿主细胞，其包含如本文所述的表达载体。
[0025]附图简要说明
[0026]图1显示所选的抗原的免疫识别，牛分枝杆菌(M.bovis)BCG Danish不诱导针对该抗原的T细胞应答(BCG
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抗原)。(A)牛分枝杆菌BCG Danish免疫、(B)结核分枝杆菌Erdman感染、或(C)用各个抗原免疫后的免疫应答。
[0027]图2显示所选的含有BCG
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抗原的融合蛋白的示意图。
[0028]图3显示本文所述的另外所选的融合蛋白的示意图。
[0029]图4显示Mtb感染期间ESAT
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6和MPT70的免疫动力学识别。在Mtb Erdman感染后3、12和20周，在肺中测量(A)抗原特异性干扰素
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γ释放或(B)抗原特异性CD4 T细胞的频率的倍数增加。
[0030]图5显示含有晚期表达抗原的疫苗诱导长期保护。在气溶胶Mtb感染后(A)4周和(B)18周，用H104或H105免疫或注射生理盐水的Mtb感染动物的肺CFU。H105包括抗原MPT64、MPT70和MPT83。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白，包含至少五种源自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的抗原。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少六种抗原，例如至少七种抗原，例如至少八种抗原。3.根据权利要求1或2任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含早期和晚期抗原。4.根据前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中至少一种抗原不引发针对BCG的免疫应答。5.根据前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原从BCG中缺失、不分泌或具有低表达。6.根据前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原选自：a)氨基酸序列，选自SEQ ID NO:1(ESAT
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6)、SEQ ID NO:2(PPE68)、SEQ ID NO:3(espI)、SEQ ID NO:4(espC)、SEQ ID NO:5(espA)、SEQ ID NO:6(MPT64)、SEQ ID NO:7(MPT70)和SEQ ID NO:8(MPT83)，及其变体或免疫原性表位，或b)与a)的任一氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。7.根据前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：a)SEQ ID NO:1(ESAT
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6)、SEQ ID NO:2(PPE68)、SEQ ID NO:3(espI)、SEQ ID NO:4(espC)和SEQ ID NO:5(espA)，或其变体或免疫原性表位，或者b)与a)的任一氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。8.根据前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：a)SEQ ID NO:1(ESAT
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6)、SEQ ID NO:2(PPE68)、SEQ ID NO:3(espI)、SEQ ID NO:4(espC)、SEQ ID NO:5(espA)、SEQ ID NO:6(MPT64)、SEQ ID NO:7(MPT70)和SEQ ID NO:8(MPT83)，或其变体或免疫原性表位，或者b)与a)的任一氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。9.根据权利要求5
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7任一项所述的融合蛋白，其中b)的氨基酸序列与a)的任一氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。10.根据前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少两个ESAT
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6重复，例如至少三个ESAT
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6重复，例如至少四个ESAT
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6重复，例如至少五个ESAT
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6重复。11.根据前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少四个ESAT
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6重复。12.根据权利要求10或11任一项所述的融合蛋白，其中所述ESAT
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6重复被至少一种不同于ESAT
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6的抗原分开。13.根据权利要求10
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12任一项所述的融合蛋白，其中所述ESAT
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6重复与不同于ESAT
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6的抗原交替定位。14.根据前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：a)SEQ ID NO:1(ESAT
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6)、SEQ ID NO:2(PPE68)、SEQ ID NO:3(espI)、SEQ ID NO:4
(espC)、SEQ ID NO:5(espA)、SEQ ID NO:6(MPT64)、SEQ ID NO:7(MPT70)和SEQ ID NO:8(MPT83)，或其变体或免疫原性表位，或者b)与a)的任一氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性，并且其中所述融合蛋白包含与不同于ESAT
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6的抗原交替定位的四个ESAT
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6重复。15.根据前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自以下任一项所代表的氨基酸序列：a)SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:91，或其变体或免疫原性表位；或者b)与a)的任一氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。16.根据权利要求1
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15任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含由...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉斯姆斯，
申请(专利权)人：史坦恩斯血清研究所，
类型：发明
国别省市：