定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法技术

本发明专利技术提供了一种定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其包括如下步骤：步骤S1，制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；步骤S2，制备对照品溶液：取标准品2,7

【技术实现步骤摘要】
定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法


[0001]本专利技术属于环境毒理学领域，尤其涉及一种定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法。

技术介绍

[0002]ROS（reactive oxygen species，活性氧）是一种生物代谢产生的含氧副产物，其含量在生物暴露于环境压力后的氧化应激反应影响下会激烈升高，因此测定ROS的含量对于评估生物是否对环境压力作出反应有重要意义。生物体内存在多种可以消除ROS的酶，如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶。如生物体产生ROS，这些酶的活性会升高，因此，大部分研究通过测定这些酶的活性来从侧面反应细胞内ROS的含量或者氧化压力的水平。然而，测定这些指标涉及到生物体内酶的提取，通常是直接提取全部总蛋白（包含了酶），酶对温度等环境指标非常敏感，容易在提取过程中失活；此外，酶的本质是蛋白质，容易被生物体内一直存在的蛋白酶所降解。因此，通过提取细胞内总蛋白的方式测试这些抗氧化酶的活性进而表征细胞内ROS的水平，操作繁琐，且结果的稳定性较差。另外，这些抗氧化酶的合成依赖细胞的正常生理活动过程，在环境毒性较大的时候，细胞会死亡，导致抗氧化酶没法合成，也就会出现抗氧化酶活性出现的情况。因此，当研究人员发现生物体内抗氧化酶活性下降时，可能会主观的猜测是受试生物没有产生ROS或者估量产生ROS，缺乏科学严谨性。故而，在环境毒理学研究领域，需要一种全新的方法来直接测定ROS的产生量。
[0003]2,7
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二氯二氢荧光素二乙酸酯是一种具有细胞膜透性的无毒物质，可以自由进入细胞内。当2,7
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二氯二氢荧光素二乙酸酯进入细胞内，会被细胞内存在的各种酯酶自然降解成2,7
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二氯二氢荧光素。2,7
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二氯二氢荧光素不溶于水，不能自由穿过细胞膜，会全部保留在细胞内。当细胞面临氧化压力时，会产生超氧自由基（ROS）。超氧自由基会氧化 2,7
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二氯二氢荧光素生成2,7
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二氯荧光素 (2',7'
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Dichlorofluorescein, DCF)，2,7
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二氯荧光素具有荧光特性。目前，对于测定ROS的方法，都是使用荧光显微镜来观察荧光素的强度和位置，定性反应细胞内超氧自由基产生的量和位置，这种方法存在如下问题：1）荧光显微镜观察的结果容易受环境光、拍照相机的质量和参数、显微镜光路的透光效率、样品的厚度等因素影响，结果很难进行准确定量，且不同批次间的结果无法直接进行比较。
[0004]2）生物体本身含有大量自发荧光物质，如叶绿素荧光，在荧光显微镜下，无法区分荧光是来自2,7
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二氯荧光素还是其它自发荧光，因此所得结果容易受到样品的干扰。
[0005]3）一般是用荧光显微镜进行观察的，都是体外培养的细胞或者个体微小的生物个体。对于较大的动物或者组织，如欲在荧光显微镜下观察，需要先对样品进行切片处理。制备切片的过程中会使用乙醇、二甲苯、石蜡的物质，这些物质会溶解2,7
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二氯荧光素，导致最后的信号丢失。因此，该方法不适用于体积稍大的动物或者组织。

技术实现思路

[0006]针对以上技术问题，本专利技术公开了一种定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，可以对ROS进行定量测定。
[0007]对此，本专利技术采用的技术方案为：一种定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：其包括如下步骤：步骤S1，制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；步骤S2，制备对照品溶液：取标准品2,7
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二氯荧光素，溶于甲醇，制成对照品溶液；步骤S3，采用高效液相色谱仪
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荧光检测器对供试品溶液和对照品溶液进行检测；步骤S4，以对照品溶液的峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算供试品溶液中2,7
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二氯荧光素的含量，从而得到超氧自由基的含量。
[0008]采用此技术方案，可以对供试品溶液中的超氧自由基的含量进行定量的测定，而不是采用荧光显微镜进行定性的大致判断，特别对于不同批次间的测试结果而言，每次测试均会制备标准曲线，进而进行准确定量，因此不同批次间的结果具有更好的可比性。
[0009]作为本专利技术的进一步改进，步骤S3中，高效液相色谱仪采用的色谱柱为C18色谱柱，荧光检测器的激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。
[0010]作为本专利技术的进一步改进，步骤S3中，所述色谱柱为Sharpsil
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T C18色谱柱，其直径为2.1
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4.6mm，长度为100
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250mm，其填料的粒径为5μm；流动相为浓度为90%的甲醇水溶液，流速为1 mL/min，柱温为25
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35℃。
[0011]作为本专利技术的进一步改进，步骤S3中的液相色谱分析仪中，流动相A为甲醇，流动相B为pH=7.5的PBS缓冲液，A：B=62：38等度洗脱，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL。
[0012]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中，供试品溶液采用如下步骤配制：步骤S101，向待测生物所生活的培养基或所食用中加入引起生物体产生超氧自由基或者引起氧化伤害的物质，按照生物体的自身培养条件培养30 min或以上；加入2,7
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二氯二氢荧光素二乙酸酯，待2,7
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二氯二氢荧光素二乙酸酯进入细胞内，继续培养一段时间后，收集生物体或其特定组织，手动、机械或者液氮研磨破碎，加入萃取溶剂对产生的2,7
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二氯荧光素进行萃取，离心后，获得上清液；步骤S102，对上清液进行浓缩，再用甲醇溶液复溶，过滤后作为供试品溶液。
[0013]此技术方案中，2,7
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二氯二氢荧光素二乙酸酯(DHCF
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DA)是一种细胞膜透性、无毒的试剂。DHCF
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DA进入细胞后，会被细胞内存在的各种酯酶自然降解成2,7
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二氯二氢荧光素。2,7
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二氯二氢荧光素不溶于水，不能自由穿过细胞膜。当细胞面临环境压力时，会产生超氧自由基，超氧自由基会氧化 2,7
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二氯二氢荧光素生成2,7
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二氯荧光素，2,7
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二氯荧光素具有荧光特性。在此基础上，此技术方案利用高效液相色谱结合荧光检测器，可以对体内的ROS水平进行定量的测定。
[0014]进一步的，所述引起生物体产生超氧自由基或者引起氧化伤害的物质为纳米二氧化钛、双氧水或重金属离子。进一步优选的，加入纳米二氧化钛的浓度为1
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100mg/L。
[0015]作为本专利技术的进一步改进，步骤S101还包括：在获得的上清液中，加入氯仿后震荡
离心，收集上清液；此步骤的目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：其包括如下步骤：步骤S1，制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；步骤S2，制备对照品溶液：取标准品2,7
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二氯荧光素，溶于甲醇，制成对照品溶液；步骤S3，采用高效液相色谱仪
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荧光检测器对供试品溶液和对照品溶液进行检测；步骤S4，以对照品溶液的峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算供试品溶液中2,7
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二氯荧光素的含量，从而得到超氧自由基的含量。2.根据权利要求1所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S3中，高效液相色谱仪采用的色谱柱为C18色谱柱；荧光检测器的激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。3.根据权利要求2所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S3中，所述色谱柱为C18填料色谱柱，色谱柱直径介于2.1 mm
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4.6 mm，长度为100
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250 mm，填料的粒径为5μm；流动相为浓度为90%的甲醇水溶液，流速为1 mL/min，柱温为25
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35℃。4.根据权利要求2所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S3中的液相色谱分析仪中，流动相A为甲醇，流动相B为pH=7.5的PBS缓冲液，A：B=62：38等度洗脱，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL。5.根据权利要求2所述的定量测定环境应激产生的体内/外超氧自由基含量的方法，其特征在于：步骤S1中，供试品溶液采用如下步骤配制：步骤S101，向待测生物所生活的培养基或所食用中加入引起生物体产生超氧自由基或者引起氧化伤害的物质，经过光照处理，按照生物体的自身培...

【专利技术属性】
技术研发人员：张根，李源真，杨柳，肖湘华，潘璐璐，欧阳嘉敏，张奎，王静，邹佳林，
申请(专利权)人：维塔探索广东科技有限公司，
类型：发明
国别省市：