本发明专利技术涉及脐带血浓缩细胞治疗卵巢早衰的细胞治疗剂。一方面，本发明专利技术制备脐带血浓缩细胞制剂的方法包括如下步骤：提供生物样本脐带血，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；将一次性分离杯放入控制模块中，于可编程离心机中离心，得到的脐带血浓缩细胞制剂。本发明专利技术还涉及上述方法制备得到的脐带血浓缩细胞制剂，以及它们在制备用于治疗卵巢早衰的细胞治疗剂中的用途。本发明专利技术细胞制剂呈现优良效果。果。
【技术实现步骤摘要】
脐带血浓缩细胞治疗卵巢早衰的细胞治疗剂
[0001]本专利技术属于生物技术和生物医药领域，涉及使用细胞治疗剂治疗卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)的方法。具体地说，本专利技术涉及从脐带血中快速分离制备脐带血浓缩细胞(脐带血浓缩物)的细胞治疗剂，进而使用此种脐带血浓缩细胞治疗早发性卵巢功能不全和卵巢早衰的方法。使用本专利技术方法可以有效的提高从脐带血中分离脐带血浓缩细胞的效率，提供一种安全、高效、简捷获得脐带血浓缩细胞制剂用于治疗卵巢早衰和卵巢功能不全例如早发性卵巢功能不全的方法。通过使用自动细胞快速处理系统为本专利技术目的得以实现。
技术介绍
[0002]卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)，是指由于卵巢功能衰竭，导致女性40岁之前闭经、不孕的现象。POF是一种以闭经、不孕、雌激素缺乏、卵泡减少和促性腺激素增高为特征的疾病，并伴有一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等，严重影响女性的身心健康。此外，POF的女性，患骨质疏松症、心血管疾病和老年痴呆的风险增加。POF是导致女性不孕的重要原因之一。育龄女性POF的发病率约1
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3％，且呈上升和年轻化趋势。
[0003]根据欧洲人类生殖与胚胎学学会的指南(ESHRE)，POF的诊断标准：少经或闭经至少4个月，间隔4周以上的两次FSH水平升高>40IU/L。卵巢早衰病因不明，可能与遗传和自身免疫性疾病、环境因素以及医源性和特发性情况有关，尚无有效的治疗方法。激素替代疗法(HRT)是POF最常见的治疗方法之一，但效果并不理想，而且已被证明会增加静脉血栓、乳腺癌和卵巢癌的风险。POF除了少经、闭经、不孕等症状，还可出现潮热、多汗、焦虑、抑郁、心悸、失眠等更年期症状，可能加快女性衰老，导致骨质疏松、心血管疾病、痴呆症等绝经后疾病，影响女性生活质量和寿命。
[0004]POF病因复杂，尚未完全阐明，可能与自身免疫应答、感染、遗传因素、化疗、放疗、手术等治疗效果及内分泌功能障碍有关，尚无有效的治疗方法。目前，POF的最常用的治疗方法是激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)。该疗法虽然对POF的临床症状具有一定的缓解作用，然而，HRT不能从根本上修复受损的卵巢，恢复卵巢功能。此外，研究表明，长期HRT治疗增加心脏病和中风的风险，可能会增加乳腺癌和卵巢癌的风险。因此，需要新的治疗策略来恢复POF患者的卵巢功能。
[0005]脐带血(umbilical cord blood)是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。也是一种非常重要的人类生物资源。脐带血中含有大量的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)，干细胞是生命的种子，它会分化成人体的各种细胞，结出各种不同的果实——血液细胞、神经细胞、骨骼细胞等等。随着科技的发展，医学专家研究
出利用脐带血中的干细胞来治疗疾病的方法。干细胞是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体。这些细胞可以通过分裂维持自身细胞的特性和数量，又可进一步分化为各种组织细胞，从而在组织修复等方面发挥积极作用。近三十年来的医学研究发现，脐带血中含有非常丰富的造血干细胞，可以重建人体造血和免疫系统，可用于造血干细胞移植，治疗血液系统、免疫系统，以及遗传代谢性及先天性疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，已经被广泛地应用于临床，是宝贵的人类生物资源。造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)，可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，MSCs通过旁分泌多种生长因子，对HSCs起到支持的作用，维持造血微环境的稳定。
[0006]脐带血浓缩细胞(umbilical cord blood concentrate，UCBC)是将脐带血经过离心、分离后获得的有核细胞的浓缩物。脐带血浓缩细胞(UCBC)中包含富集的造血干细胞(HSCs)和间充质干细胞(MSCs)，以及大量的多种细胞生长因子。HSCs可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。MSCs是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。UCBC中含有血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF
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β)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I(IGF
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I)、粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)、骨形态发生蛋白(BMP
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2，BMP
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7)和白细胞介素(IL
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1，IL
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6，IL
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8)等多种生长因子和细胞因子。
[0007]UCBC具有抗炎、免疫调节特性、促血管生成、促进组织再生修复等作用。临床前和初步临床研究证实，UCBC通过改善卵巢微环境，促进血管生成，促进卵泡发育，增加窦状卵泡数量，促进排卵，从而改善卵巢功能，是治疗POF患者潜在的治疗方法。
[0008]然而，脐带血在传统上采用手工操作方式以密度梯度离心法进行分离，存在操作复杂、耗时长、易污染、结果重复性差等非常棘手的问题。为此，本领域技术人员期待有一种操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面有益效果的处理脐带血以获得脐带血浓缩物即脐带血浓缩细胞的方法。本领域技术人员还期待提供一种治疗卵巢早衰的方法例如使用脐带血浓缩细胞治疗剂治疗卵巢早衰的方法。
技术实现思路
[0009]本专利技术的目的在于提供一种制备脐带血浓缩细胞制剂的方法，期待该种方法具有操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面的有益效果。已经出人意料地发现，本专利技术通过使用封闭式的PXP细胞自动分离系统能够实现上述一个或者多个目的，本专利技术基于此类发现而得以完成。
[0010]为此，本专利技术第一方面提供了一种制备脐带血浓缩细胞制剂的方法，其包括如下步骤：
[0011](1)提供生物样本脐带血，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
[0012](2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的PXP分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.制备脐带血浓缩细胞制剂的方法，其包括如下步骤：(1)提供生物样本脐带血，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的PXP分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理系统；(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：程序号加速减速相对离心力/RCF时间/minP19920008.5P299502P3995002.5P499501P5992500.5P699501(4)启动离心机进行离心，进程如下：4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的脐带血浓缩细胞制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中：步骤(1)提供的生物样本的体积为20～350ml；步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测；和/或，步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.6％枸橼酸钠溶液。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.6％枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.15mg/ml磷脂酰胆碱。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60℃搅拌使溶解，加水至全量，0.22μm微孔滤膜过滤，121℃热压灭菌，即得。7.根据权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据。8.一种脐带血...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖海蓉，李容，徐勇，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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