一种人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱及构建方法。所述方法包括以下步骤：(1)分选人骨髓造血干/祖细胞；(2)构建所述人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组库；(3)对所述单细胞转录组库进行测序；(4)对所述测序的数据进行分析，构建所述人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱；本发明专利技术通过深度单细胞转录组测序，构建人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱来系统研究人造血干/祖细胞特征，获取更多信息量，可为探索人骨髓造血干/祖细胞的生理和病理造血提供理论基础。祖细胞的生理和病理造血提供理论基础。祖细胞的生理和病理造血提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱及构建方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱及构建方法。

技术介绍

[0002]造血干细胞(HSC)是机体中研究最多的一种成体干细胞，HSC数量稀少，通常以静息状态存在于骨髓微环境中，并严格地受到微环境中多种外界因素和细胞内分子的精密调控。作为整个造血系统的“种子”细胞，位于造血系统分化发育的顶点。传统观点认为，HSC与其子代细胞及成熟的血细胞之间存在着明显的等级关系，即由HSC产生多潜能祖细胞(MPP)，进而分化为共同淋系祖细胞(CLP)和共同髓系祖细胞(CMP)，再进一步分化发育为各系成熟的血细胞。近年来，随着科技的飞速发展，对这种经典的“树状层级”发育模型发起了挑战。一项对人造血干细胞/祖细胞(HSPC)的研究表明，Lin
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CD34
+
CD38
‑
被证明是一群低启动的未分化HSPC的转录连续群体。另一项对脐带血的研究表明，通过无偏倚的计算分析，存在一些中间阶段群体细胞，其与干细胞群体密切相关，并且没有明显的命运选择。同时，淋系倾向多潜能祖细胞(LMPP)，多潜能淋系祖细胞(mLP)和粒
‑
单核系祖细胞(GMP)的不同的分化能力也证实了干细胞下游有连续的祖细胞分化。因此，采取单细胞技术对HSPC的深入研究有助于进一步研究造血谱系分化。
[0003]血液系统具有高度的复杂性和异质性，过往对于血液细胞的分群大多是基于免疫表型，然而近期研究表明：相同免疫表型的细胞群体仍然存在较大的异质性。近几年兴起的单细胞技术可以很好地解决细胞群体和分子水平异质性问题，从而成为研究血细胞分化图谱的重要利器。人细胞图谱(Human cell atlas，HCA)及Pellin等研究，采用骨髓单个核细胞及谱系阴性细胞进行了单细胞水平转录组测序的方法描述了人造血稳态。尽管这些研究极大地提高了人们对造血的认识，但研究测序深度较浅，获取信息较少，使得认识受限。
[0004]综上所述，如何提供一种构建HSPC单细胞转录组图谱的方法，获取更多信息量，为探索人HSPC的生理和病理造血提供理论基础，是造血干细胞研究领域亟待解决的问题之一。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱及构建方法，通过深度单细胞转录组测序，构建人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱来系统研究人造血干/祖细胞特征，获取更多信息量，可为探索人骨髓造血干/祖细胞的生理和病理造血提供理论基础。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种构建人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008](1)分选人骨髓造血干/祖细胞；
[0009](2)构建所述人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组库；
[0010](3)对所述单细胞转录组库进行测序；
[0011](4)对所述测序的数据进行分析，构建所述人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱；
[0012]所述分析包括：
[0013]利用降维算法进行可视化展示、通过非监督聚类将人骨髓造血干/祖细胞进行分类并进行注释、特征基因表达水平分析、表型占比分析、粒细胞特征基因分析。
[0014]本专利技术创造性设计构建人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱的方法，首先对人骨髓造血干/祖细胞的单细胞进行分选并构建单细胞转录组库，对单细胞转录组库进行深度测序，并对测序数据利用降维算法进行可视化展示、通过非监督聚类将人骨髓造血干/祖细胞进行分类并进行注释、进行特征基因表达水平分析、表型占比分析、粒细胞特征基因分析，从而构建包含丰富信息的人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱，可为探索人骨髓造血干/祖细胞的生理和病理造血提供理论基础。
[0015]优选地，步骤(1)所述分选人骨髓造血干/祖细胞包括：
[0016]使用抗体标记人骨髓细胞中单个核细胞，进行流式分选；
[0017]优选地，所述抗体包括CD34抗体、CD38抗体、CD45RA抗体、CD90抗体、CD10抗体、CD135抗体和CD49f抗体。
[0018]优选地，所述流式分选包括向细胞悬液中加入4
’
,6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚并通过流式分选系统进行分选。
[0019]优选地，步骤(1)所述分选人骨髓造血干/祖细胞包括以下步骤：
[0020](1
’
)收集人骨髓细胞并提取单个核细胞；
[0021](2
’
)使用培养基重悬所述单个核细胞，离心并收集单个核细胞，使用CD34抗体、CD38抗体、CD45RA抗体、CD90抗体、CD10抗体、CD135抗体和CD49f抗体标记单个核细胞；
[0022](3
’
)向标记后细胞中加入缓冲液，离心收集细胞，加入4
’
,6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚并利用流式分选系统进行分选。
[0023]优选地，所述培养基包括Iscove改良杜氏培养基。
[0024]优选地，所述缓冲液包括PBS缓冲液。
[0025]优选地，所述流式分选系统包括流式细胞仪。
[0026]本专利技术中，合理设计单细胞筛选方法，能够有效筛选出HSC、MPP、LMPP、mLP、CMP、GMP、MEP和B
‑
NK共8群细胞，HSC，MPP，LMPP，mLP，CMP，GMP，MEP和B
‑
NK细胞的流式标记如下：
[0027]HSC：Lin
‑
CD34
+
CD38
‑
CD45RA
‑
CD90
+
CD49f
+
CD10
‑
；
[0028]MPP：Lin
‑
CD34
+
CD38
‑
CD45RA
‑
CD90
‑
；
[0029]LMPP：Lin
‑
CD34
+
CD38
‑
CD45RA
+
CD90
‑
CD10
‑
；
[0030]mLP：Lin
‑
CD34
+
CD38
‑
CD45RA
+
CD90
‑
CD10
+
；
[0031]CMP：Lin
‑
CD34
+
CD38
+
CD10
‑
CD45RA
‑
CD135
+...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)分选人骨髓造血干/祖细胞；(2)构建所述人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组库；(3)对所述单细胞转录组库进行测序；(4)对所述测序的数据进行分析，构建所述人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱；所述分析包括：利用降维算法进行可视化展示；通过非监督聚类将人骨髓造血干/祖细胞进行分类并进行注释；特征基因表达水平分析；表型占比分析；粒细胞特征基因分析。2.根据权利要求1所述的构建人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱的方法，其特征在于，步骤(1)所述分选人骨髓造血干/祖细胞包括：使用抗体标记人骨髓细胞中单个核细胞，进行流式分选；优选地，所述抗体包括CD34抗体、CD38抗体、CD45RA抗体、CD90抗体、CD10抗体、CD135抗体和CD49f抗体；优选地，所述流式分选包括向细胞悬液中加入4
’
,6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚并通过流式分选系统进行分选。3.根据权利要求1或2所述的构建人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱的方法，其特征在于，步骤(1)所述分选人骨髓造血干/祖细胞包括以下步骤：(1
’
)收集人骨髓细胞并提取单个核细胞；(2
’
)使用培养基重悬所述单个核细胞，离心并收集单个核细胞，使用CD34抗体、CD38抗体、CD45RA抗体、CD90抗体、CD10抗体、CD135抗体和CD49f抗体标记单个核细胞；(3
’
)向标记后细胞中加入缓冲液，离心收集细胞，加入4
’
,6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚并利用流式分选系统进行分选；优选地，所述培养基包括Iscove改良杜氏培养基；优选地，所述缓冲液包括PBS缓冲液；优选地，所述流式分选系统包括流式细胞仪。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的构建人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱的方法，其特征在于，步骤(2)所述人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组库的构建方法包括：采用STRT
‑
seq法构建所述人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组库。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的构建人骨髓造血干/祖细胞的单细胞转录组图谱的方法，其特征在于，步骤(3)所述测序包括STRT
‑
seq单细胞转录组测序。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的构建人骨髓造血干/祖...

【专利技术属性】
技术研发人员：程涛，胡林萍，朱平，谢小韦，张雅文，尹秀秀，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：