一种非酶生物质水解糖化液免脱毒高效生产乳酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种以非酶生物质水解糖化液为原料免脱毒高效生产乳酸的方法，该方法包括以下步骤：先用五氧化二磷和生物质共球磨

【技术实现步骤摘要】
一种非酶生物质水解糖化液免脱毒高效生产乳酸的方法


[0001]本专利技术属于生物质能源
，具体涉及一种非酶生物质水解糖化液免脱毒高效生产乳酸的方法。

技术介绍

[0002]乳酸是合成多种化学品的重要中间体，可广泛应用在食品、药品、化妆品、制革、纺织、环保和农业生产中。目前最重要的用途是从乳酸生产可以取代聚乙烯和聚丙烯等聚合材料的可降解聚乳酸产品(Polymeric lactic acid，PLA)。聚乳酸具有生物可降解性、生物相容性、较强的弹性及良好的药物释放可控性等优点，基于这些优点它被广泛应用于手术缝合线、防护服、缓释药物、覆盖物薄膜、垃圾袋、刚性容器和收缩包装等。随着聚乳酸产品的广泛应用，全球对乳酸的需求量也随之增加。
[0003]乳酸的生产方法可分为化学合成法和微生物发酵法。化学法是用乙醛和氢氰酸为原料经过一系列化学催化反应合成，生产成本高，环境污染严重，且难于合成高光学纯度的乳酸；而微生物发酵法,则是以糖、淀粉和木质纤维素等做原料,利用各种细菌或真菌经过生物转化合成乳酸,发酵产物可以是高光学纯度的L-或D-乳酸。相对化学法工艺路线，微生物发酵法具有原料可再生、污染小和成本低等优点，故成为现在乳酸生产研发的热点。
[0004]生物质原料具有廉价、易得、可再生等优势，是乳酸生产的新原料。它主要包括糖基原料(甘蔗、甜菜等)、纤维类原料(秸秆，稻草，木头和稻壳等)和淀粉质原料(薯类、谷物等)。木质纤维素是地球上最丰富的生物质资源，主要由纤维素(38-50％)、半纤维素(25-35％)和木质素(15-20％)构成。以木质纤维素为原料生产生物基化学品的过程包括原料预处理、抑制物脱毒、酶解糖化与发酵、产品分离纯化、废水处理以及固体残渣的回收与再利用等(Bioprocess and Biosystems Engineering，2016，39：133-140)。
[0005]有关生物质原料生产乳酸的报道有很多，但绝大部分离不开昂贵的纤维素酶、复杂的抑制物脱毒程序。专利CN102174602A公开了一种凝结芽孢杆菌利用玉米秸秆发酵乳酸的方法，其先将生物质用氢氧化钠热处理后再加入纤维素酶进行酶解，经过发酵后最终可获得140g/L的乳酸，虽然产物浓度较高但预处理中需要用到大量的氢氧化钠，残留的Na
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也可能会对生产菌株有抑制作用，且酶解成本高耗时长；专利CN110964756A公开了一种利用米根霉发酵菊芋制备乳酸的方法，但其乳酸浓度极低，仅为5.84g/L，且转化率仅为0.28；专利CN110241043A公开了一种粪肠球菌高温发酵生物质产乳酸的方法，可利用稻谷粉生产73.36g/L乳酸，利用玉米秸秆可产生乳酸的最终浓度21.59g/L，除了需要添加纤维素酶外，还不能利用木糖；Kai Zhao等人利用乳酸片球菌发酵玉米秸秆水解液可获得101.90g/L的乳酸，其先进行一系列预处理，之后需要进行为期5天的生物脱毒过程以除去抑制物，然后再加入纤维素酶进行同步糖化发酵乳酸，虽然得到了较高浓度的乳酸，但其工艺复杂、周期长且成本高，且转化率只有0.23g/g底物(Bioresource Technology，2013，135：481-489)；Jinlong Hu等人先用氢氧化钠热处理3h然后用大量水冲洗pH至8.0，再加入纤维素酶、种子液进行同步糖化发酵，芽孢杆菌LA204在50℃下通过批式补料发酵玉米秸秆可获得97.59g/
L的乳酸，但其在补料过程中也需要补加额外的纤维素酶(Bioresource Technology，2015，182：251-257)。以上发酵过程均离不开昂贵的纤维素酶，预处理产生的抑制物及酶解处理时生成的纤维二糖、葡萄糖等对酶均有抑制作用，且纤维素酶无疑增加了生产周期与成本。
[0006]也有研究者利用生物质非酶水解液发酵乳酸，Oliveira等人先用0.5％(v/v)硫酸水解甘蔗渣，然后用氢氧化钠调pH后去发酵乳酸，但其发酵时间长(60-168h)，乳酸浓度低(34.49g/L)，底物利用率低，生产强度极低(0.58g/L/h)，植物乳杆菌虽然可以边脱毒变发酵，但是其可以利用的抑制物浓度极低(小于0.5g/L)，且预处理残留的SO
42-和Na
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等也可能会对生产菌株有抑制作用(Journal of Biotechnology，2018，278：56-63)。Moldes等人也采用3％、2％的硫酸对麦糠壳、玉米芯、桉树、葡萄枝进行酸解得半纤维素水解液然后发酵乳酸，分别得到33.7、24.7、26.5、14.5g/L乳酸，但其在发酵过程中会产生大量乙酸(最大19g/L)，且生产强度(最高0.6g/L/h)及转化率(最大0.76)均不高(Applied Biochemistry and Biotechnology，2006，135：219-28)。Jos
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Utrilla等人同样先用2％硫酸水解甘蔗渣得半纤维素水解液，然后用Ca(OH)2脱毒处理，再利用基因工程菌发酵得到接近50g/L乳酸，但其发酵时间长(96h)，生产强度低(0.51g/L/h)，虽然得率较高，但遗传学操作增加了成本，且其稳定性难以估计。(Bioresource Technology，2016，220：208-214)。Guo等人也用硫酸对玉米芯、玉米秸秆酸解后用短乳杆菌发酵乳酸，分别得到39.1g/L、18.2g/L乳酸，但其发酵液中副产物乙酸极高，分别为33.1g/L、10.7g/L，且乳酸生产强度均小于1g/L/h(Appl Biochem Biotechnol，2010，161:124-36)。大多用于乳酸发酵的非酶生物质水解液的获得需要硫酸、盐酸进行酸解，不仅腐蚀设备，后续的产品分离和酸的回收利用仍然制约着这些技术的应用，且水解液中主要成分是木糖，而传统的乳酸发酵菌株中，能发酵木糖产乳酸的较少，这就限制了木质纤维素类原料的利用，此外，水解液中残留的硫酸根离子、Na
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等可能会影响菌的正常生长(Applied Microbiology and Biotechnology，1993，38：542-549)。而本专利技术采用的是固体P2O5，水解生物质后形成的磷酸可作为菌的营养成分。
[0007]非酶生物质水解液的有效利用还受其毒性抑制物的制约。预处理过程中产生的抑制物显著影响生物炼制发酵菌株的细胞代谢活性、菌体生长与产物发酵过程(International Journal of Hydrogen Energy，2014，39：16885-16890)。尽管一些脱毒方法如活性炭吸附、蒸发处理、过碱中和以及酶或微生物脱毒等已被报道过，但同时亦増加了生物炼制工艺的复杂性与过程成本，相比于脱毒策略，提高发酵菌株对抑制物的耐受性，筛选可直接利用不经脱毒处理的木质纤维素原料进行有效发酵的微生物菌株，是应对抑制物问题的更为理想的方法策略。一株新分离的乳酸片球菌DQ2对糠醛、HMF、乙酸和乙酰丙酸的耐受度分别为3.0、3.0、3.6和3.2g/L(Bior本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非酶生物质水解糖化液免脱毒高效生产乳酸的方法，其特征在于，先用含有不同浓度的未经脱毒处理的非酶生物质水解糖化液的驯化培养基驯化戊糖片球菌的野生菌获得初步驯化菌，再用含有不同浓度葡萄糖的再驯化培养基对初步驯化菌进行再驯化后得到优势驯化菌，利用所得优势驯化菌发酵免脱毒的非酶生物质水解糖化液产乳酸。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，初步驯化方法为：将野生菌先于含有低浓度非酶生物质水解糖化液的驯化培养基中培养至对数期，然后以1％～30％(v/v)(优选5～15％)的接种量转接至浓度提高的驯化培养基中培养，如此方法按照培养基中以葡萄糖含量100～350g/L(优选140～280g/L)的糖化液计，非酶生物质水解糖化液于驯化培养基中所占的体积比例由0.5～25％(优选2～20％)至28％～50％(优选30～35％)、每级之间以葡萄糖浓度4～20g/L(优选5～15g/L)梯度增加、逐级驯化培养3级以上至驯化菌发酵性能下降前为止，从驯化菌可耐受的最高级初步驯化培养基中筛选获得初步驯化菌，其中发酵性能下降是指单位时间内转化的乳酸的量小于上一级，可耐受是指菌可以正常生长、发酵乳酸。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，再驯化方法为：将初步驯化菌接种至含低浓度葡萄糖的驯化培养基中培养至对数期，然后以1％～30％(优选5～15％)的接种量按照葡萄糖浓度从25～60g/L(优选30～50g/L)至180g/L～250g/L(优选195～205g/L)、每级之间以葡萄糖浓度15～60g/L(优选20～50g/L)梯度增加、逐级驯化培养3级以上至驯化菌发酵性能下降前为止，从可耐受的最高级再驯化培养基中筛选优势驯化菌；其中发酵性能下降是指单位时间内转化的乳酸的量小于上一级，可耐受是指菌可以正常生长、发酵乳酸。4.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于，初步驯化培养基的制备方法为：将非酶生物质水解糖化液浓缩、用如磷酸、KOH等所有可用于发酵应用的酸或碱调pH至6.0-7.0、加营养物后与种子培养基分别于高压蒸汽灭菌锅中110～125℃灭菌15～...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宗超，刘会芳，刘秀梅，姜宏，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：