用于检测解脲脲原体的引物探针组合物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体提供了用于检测解脲脲原体的引物探针组合物、试剂盒及方法。本发明专利技术提供的这种用于解脲脲原体核酸检测的引物探针组合物、试剂盒及检测方法，样本处理过程简单，对淋球菌核酸有很强的特异性，检测方法耗时较少，对生殖道分泌物等未知样本中的解脲脲原体核酸进行准确的检测，与可经性传播、易引起相同或相似的临床症状的其他病原体无交叉反应，解决了现有技术中样本处理方法繁琐，试剂盒特异性差等问题。并且，本试剂盒灵敏度高，检测限为200copies/ml，为诊断解脲脲原体提供可靠的实验依据。脲脲原体提供可靠的实验依据。脲脲原体提供可靠的实验依据。

【技术实现步骤摘要】
用于检测解脲脲原体的引物探针组合物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及用于检测解脲脲原体的引物探针组合物、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]生殖道感染是指各种病原微生物和寄生虫感染于生殖道或是经生殖道感染的一组感染性疾病，包括内源性、外源性、医源性及性传播等感染。生殖道感染疾病的危害涉及道诸多方面，主要表现在：1、危害人类生殖健康，导致盆腔炎、男女不孕症、异位妊娠风险增加等；2、对新生儿的健康带来影响，很多性传播疾病可以在孕期、分娩期和哺乳期传染给孩子；3、增加宫颈癌发生的风险；4、影响避孕节育的安全性；5、生殖道感染会增加多种疾病混合感染的危险，例如淋病患者感染衣原体、支原体为非感染者的3
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5倍。
[0003]解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)属于柔膜体纲，脲原体属，是一类无细胞壁、呈高度多形性、可通过除菌滤器、在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物，是女性泌尿生殖道常见的定植微生物之一，文献报道，新生儿发生UU垂直传播的比例为45
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66％，早产儿更高。UU可通过生殖道上行感染、经胎盘血行感染等途径引起围产儿宫内感染，导致早产、宫内生长迟缓、宫内肺炎、支气管肺发育不良、围生儿死亡等不良妊娠结局。很多不明原因的早产均因UU感染所致。Ho Seon Eun等学者研究报道，早产儿UU感染与支气管发育不良(BPD)相关，尤其与中重度BPD的形成相关。因此，提高UU检出率及对确诊患儿经治疗后UU核酸的拷贝数水平变化，对了解早产儿UU阳性与BPD的关系，评估UU感染治疗疗效提供临床理论依据。针对上述现状，有必要开展对于UU病原菌的研究，建立UU的新一代检测技术是急需解决的问题之一。
[0004]临床上检测解脲脲原体感染包括细胞培养法、涂片镜检法、聚合酶链反应法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等。分离培养法的操作简单，特意性高，被认为是诊断解脲脲原体原体的金标准，但是培养时间长，敏感性较低，容易延误病情。涂片镜检法简便易行，价格低廉，但易受取材、涂片、染色等各种因素的影响，易发生误诊和漏诊。近年来荧光PCR法逐渐显现了其在检测上的优势，是一种更灵敏、更特意、更精准的核酸检测技术，检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及临床的关系，为临床提供更加准确、客观的检测结果。
[0005]目前国内外已有基于实时荧光定量PCR技术检测UU
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DNA的试剂盒应用于临床检测中，灵敏度约在500
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1000copies/ml左右，这些试剂盒大多缺乏完善的质控体系，还需进一步完善，使之满足临床准确诊断的需要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术中解脲脲原体检测灵敏度低，缺乏完善质控体系等问题。
[0007]为此，本专利技术提供了一种用于检测解脲脲原体的引物探针组合物，包括目的基因
引物探针组合物；所述目的基因引物探针组合物包括：
[0008]目的基因上游引物，其序列为：CAATGGTTGGTATAATCCAAG；
[0009]目的基因下游引物，其序列为：TCTGGTACTAATTTACCTGGA；
[0010]目的基因探针，其序列为：GTGTTGATCAAGTTATGGAA。
[0011]具体的，上述用于检测解脲脲原体的引物探针组合物，还包括内标引物探针组合物；所述内标引物探针组合物包括：
[0012]内标上游引物，其序列为：TGACAATGTTGGCAAGACTGTTG；
[0013]内标下游引物，其序列为：GCCGACAAACTGGGAATGAAC；
[0014]内标探针，其序列为：TGGAGATCGTTTTGTGGCTTGTGA。
[0015]具体的，上述内标为重组质粒，作为PCR扩增体系中的内控，预防样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性，内标的序列为TGACAATGTTGGCAAGACTGTTGATGGAGAGCCTTTTGTGGCTTGTGATTTTTGTTCATTCCCAGTTTGTCGGC。
[0016]本专利技术还提供了一种用于检测解脲脲原体的试剂盒，包括PCR反应液；所述PCR反应液包括上述任意一项所述的用于检测解脲脲原体的引物探针组合物。
[0017]具体的，上述PCR反应液还包括10
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PCR反应缓冲液、dNTP。
[0018]具体的，上述用于检测解脲脲原体的试剂盒还包括核酸提取液，所述核酸提取液包括10
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50mM的Tris、0.1
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1M的NaCl、0.1
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1mM的EDTA、10
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50mM的NaOH、0.01
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0.5mM的莎梵婷、5％
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20％的Chelex
‑
100和0.01
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2％的十二烷基磺酸钠。核酸提取液在很大程度上简化了核酸检测的步骤，而且灵敏度有了很大的提高。
[0019]具体的，上述用于检测解脲脲原体的试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液包括1
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5U/μl的DNA聚合酶和1
‑
5U/μl热启动修饰抗体，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。
[0020]具体的，上述用于检测解脲脲原体的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为解脲脲原体强阳性样本；所述阴性对照为不含有解脲脲原体、单纯疱疹病毒、沙眼衣原体的灭活阴性样本。
[0021]本专利技术还提供了一种用于检测解脲脲原体的方法，包括以下步骤：
[0022](1)提取待测样本的DNA；
[0023](2)以待测样本的DNA为模板，进行荧光定量PCR反应，所述PCR反应体系包括上述任意一项所述的用于检测解脲脲原体的引物探针组合物；
[0024](3)PCR反应结束后，根据Ct值判定检测结果。
[0025]具体的，上述步骤(2)中PCR反应程序为：95℃，3min；94℃，15sec，60℃，30sec，40个循环。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：
[0027]本专利技术提供的这种于检测解脲脲原体的引物探针组合物可以快速扩增目的基因，设计的内标作为PCR扩增体系中的内控，能预防样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。本专利技术提供的以引物探针组合物作为主要成分的用于解脲脲原体核酸检测的试剂盒及检测方法，样本处理过程简单，对淋球菌核酸有很强的特异性，检测方法耗时较少，对生殖道分泌物等未知样本中的解脲脲原体核酸进行准确的检测，与可经性传播、易引起相同或相似的临床症状的其他病原体无交叉反应，解决了现有技术中样本处理方法繁琐，试剂盒
特异性差等问题。并且，本试剂盒灵敏度高，检测限为200copies/ml，为诊断解脲脲原体提供可靠的实验依本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测解脲脲原体的引物探针组合物，包括目的基因引物探针组合物；其特征在于，所述目的基因引物探针组合物包括：目的基因上游引物，其序列为：CAATGGTTGGTATAATCCAAG；目的基因下游引物，其序列为：TCTGGTACTAATTTACCTGGA；目的基因探针，其序列为：GTGTTGATCAAGTTATGGAA。2.如权利要求1所述的用于检测解脲脲原体的引物探针组合物，其特征在于，还包括内标引物探针组合物；所述内标引物探针组合物包括：内标上游引物，其序列为：TGACAATGTTGGCAAGACTGTTG；内标下游引物，其序列为：GCCGACAAACTGGGAATGAAC；内标探针，其序列为：TGGAGATCGTTTTGTGGCTTGTGA。3.如权利要求2所述的用于检测解脲脲原体的引物探针组合物，其特征在于，所述内标的序列为：TGACAATGTTGGCAAGACTGTTGATGGAGAGCCTTTTGTGGCTTGTGATTTTTGTTCATTCCCAGTTTGTCGGC。4.一种用于检测解脲脲原体的试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液；所述PCR反应液包括权利要求1
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3任意一项所述的用于检测解脲脲原体的引物探针组合物。5.如权利要求4所述的用于检测解脲脲原体的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液还包括10
×
PCR反应缓冲液、dNTP。6.如权利要求4所述的用于检测解脲脲原体的试剂盒，其特征在于：还包括核酸提取液；所述核酸提取液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张炳为，周树民，辜嘉，
申请(专利权)人：苏州中科先进技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：