本发明专利技术提供一种利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：(1)发酵液制备；(2)磁性纳米固相萃取材料的制备：硅包埋制备Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2的硅烷化及超分子溶剂在磁性纳米固相萃取材料表面的自组装修饰；(3)吸附；(4)洗脱；(5)结晶纯化。本发明专利技术方法有效克服了传统有机溶剂物理萃取法对水溶性成分PQQ萃取率低不足的问题。该方法利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料，从发酵液中萃取富集PQQ而制备高纯度的PQQ产品。与液液萃取相比，无需利用萃取塔或离心萃取机等设备进行液液两相分离，设备简单，操作便捷。操作便捷。操作便捷。
【技术实现步骤摘要】
利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法
[0001]本专利技术涉及一种利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，属于生物化工领域。
技术介绍
[0002]吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)能够可逆传递电子，在生命系统当中作为氧化还原酶辅因子，是继核黄素和烟酰胺之后第三类辅酶，对生命体有重要的生理活性。
[0003]目前，PQQ的制备方法主要有微生物发酵和化学合成方法。PQQ的现有合成方法包括化学合成法和微生物发酵法。化学全合成法需要经过十步以上的反应才能获得，产率很低；并且需要使用大量有毒试剂和重金属催化剂，对环境破坏比较大。因此，该方法工业上不可长久应用。目前全世界仅有日本三菱瓦斯公司掌握工业化发酵生产PQQ的技术，我国在这方面尚属空白。但是，日本三菱瓦斯公司发酵法生产PQQ的产量仅10克每升，与其他发酵精细化工产品相比，PQQ发酵产物浓度较低。另外，由于PQQ强极性、水溶性、发酵液成分复杂的特点，常规天然产物分离纯化手段只适用于中等极性脂溶性化合物分离，因此，从发酵液中分离纯化PQQ难度加大，产业化开发PQQ必须解决分离纯化技术难题。
技术实现思路
[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，该方法具有分离效率高、能耗低、生产能力大、便于快速连续操作等优点，可应用于PQQ的工业化生产。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0006]利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
[0007](1)发酵液制备：利用吡咯喹啉醌生产菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液；
[0008](2)磁性纳米固相萃取材料的制备：
[0009]1)硅包埋制备Fe3O4@SiO2；
[0010]2)Fe3O4@SiO2的硅烷化；
[0011]3)超分子溶剂在磁性纳米固相萃取材料表面的自组装修饰：
[0012]向异辛烷中加入硅烷化Fe3O4@SiO2，于室温下搅拌20
‑
50min，随后边搅拌边加入十二烷基苯磺酸，在20
‑
30℃、150
‑
300rpm的条件下再搅拌20
‑
50min；随后边搅拌边加入乙二胺，在30
‑
40℃、150
‑
300rpm的条件下搅拌20
‑
50min；随后边搅拌边加入正戊醇，然后在50
‑
65℃、150
‑
300rpm的条件下搅拌20
‑
50min，过滤，得反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料，备用；
[0013](3)吸附：将磁性纳米固相萃取材料加入发酵液中，于常温下搅拌10
‑
20min，结束
后在反应容器底部加磁铁，此时吸附有PQQ的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
[0014](4)洗脱：向吸附有PQQ的磁性纳米固相萃取材料中加入质量分数为10
‑
16％的氯化钠溶液，于常温下搅拌10
‑
20min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
[0015](5)结晶纯化：将洗脱液在1
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3℃条件下静置12
‑
18h，得到晶体，过滤，即得PQQ产品。
[0016]所述吡咯喹啉醌生产菌为：扭脱甲基杆菌、鲍曼不动杆菌或氧化葡萄糖酸杆菌。
[0017]硅包埋制备Fe3O4@SiO2的方法为：将Fe3O4溶于体积分数为75％的乙醇溶液中，超声分散30min；随后边搅拌边滴加5
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10％(v/v)的氨水，搅拌30min后，分10
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20次添加正硅酸四乙酯，于室温下搅拌24h；反应结束后，用乙醇洗涤3～5次，再用去离子水洗涤3～5次，将样品在60℃的温度下真空干燥12h，备用。
[0018]所述Fe3O4：乙醇溶液：氨水：正硅酸四乙酯的添加比例为10
‑
20g：800mL：10mL：60mL。
[0019]Fe3O4@SiO2硅烷化的方法为：取5
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10mL正十二烷基三甲氧基硅烷或正十八烷基三甲氧基硅烷于室温下搅拌，然后边搅拌边加入5
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15g Fe3O4@SiO2，再在室温下搅拌12h，即得。
[0020]所述硅烷化Fe3O4@SiO2：异辛烷：十二烷基苯磺酸：乙二胺：正戊醇的添加比例为5
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15g：10
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30mL：0.5
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1.0g：5
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15mL：10
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20mL。
[0021]发酵液与磁性纳米固相萃取材料的质量比为80
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100：1。
[0022]吸附有PQQ的磁性纳米固相萃取材料与氯化钠溶液的比例为1g：8
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20mL。
[0023]本专利技术有益效果：
[0024]1、本专利技术提出的反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取法，有效克服了传统有机溶剂物理萃取法对水溶性成分PQQ萃取率低不足的问题。该方法利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料，从发酵液中萃取富集PQQ而制备高纯度的PQQ产品。与液液萃取相比，无需利用萃取塔或离心萃取机等设备进行液液两相分离，设备简单，操作便捷。
[0025]2、本专利技术制备磁性纳米固相萃取材料时，乙二胺、十二烷基苯磺酸、正戊醇、异辛烷在硅烷化磁性纳米颗粒表面通过超分子自组装而形成反胶束体系(图1)。在该体系中，乙二胺与十二烷基苯磺酸以离子键相连形成一个络合萃取活性位点，基于PQQ羧酸基团与乙二胺铵根离子基团之间的离子对络合作用，以及十二烷基苯磺酸苯基与PQQ吡咯环的π
‑
π络合作用，从发酵液中高效、高选择性地萃取PQQ(图2)。
[0026]3、本专利技术将有机萃取剂通过反胶束自组织修饰到硅烷化磁性纳米粒子表面进行固定化(图1)，从而有效防止有机萃取剂的流失。本专利技术所涉及超分子溶剂修饰的磁性纳米固相萃取材料为纳米状态(图3)，与待萃取液接触面积大、传质效率高，因此萃取效率高。使用磁性纳米颗粒进行萃取，可使用外加磁场进行固液分离，分离速度快，生产效率高。同时用氯化钠溶液进行洗脱，实现目标物洗脱与萃取材料再生的过程。操作相对简单，且成本低、污染少。
附图说明
[0027]图1为反胶束体系在硅烷化磁性纳米材料表面的自组装示意图。
[0028]图2为乙二胺铵根离子基团、十二烷基苯磺酸苯基与PQQ的络合作用示意图。
[0029]图3为磁性纳米固相萃取材料的扫描电镜图。
[0030]图4为PQQ标准品和实施例2最终产物的紫外光谱图。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)发酵液制备：利用吡咯喹啉醌生产菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液；(2)磁性纳米固相萃取材料的制备：1)硅包埋制备Fe3O4@SiO2；2)Fe3O4@SiO2的硅烷化；3)超分子溶剂在磁性纳米固相萃取材料表面的自组装修饰：向异辛烷中加入硅烷化Fe3O4@SiO2，于室温下搅拌20
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50min，随后边搅拌边加入十二烷基苯磺酸，在20
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30℃、150
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300rpm的条件下再搅拌20
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50min；随后边搅拌边加入乙二胺，在30
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40℃、150
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300rpm的条件下搅拌20
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50min；随后边搅拌边加入正戊醇，然后在50
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65℃、150
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300rpm的条件下搅拌20
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50min，过滤，得反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料，备用；(3)吸附：将磁性纳米固相萃取材料加入发酵液中，于常温下搅拌10
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20min，结束后在反应容器底部加磁铁，此时吸附有PQQ的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；(4)洗脱：向吸附有PQQ的磁性纳米固相萃取材料中加入质量分数为10
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16％的氯化钠溶液，于常温下搅拌10
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20min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；(5)结晶纯化：将洗脱液在1
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3℃条件下静置12
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18h，得到晶体，过滤，即得PQQ产...
【专利技术属性】
技术研发人员：马科，杨雪鹏，钟桂芳，王光路，王冰洋，胡仙妹，程源航，苏泽宇，
申请(专利权)人：郑州轻工业大学，
类型：发明
国别省市：
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