一种用于检测人Dsg3IgG抗体的ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测人Dsg3 IgG抗体的ELISA试剂盒及其应用。所述的试剂盒中含有Dsg3微孔条带，所述的Dsg3微孔条带中分别包被有SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测人Dsg3 IgG抗体的ELISA试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及一种ELISA试剂盒及其应用，特别涉及一种用于检测人Dsg3 IgG抗体的ELISA试剂盒及其应用。本专利技术属于医药


技术介绍

[0002]人皮肤自身免疫性水疱病主要分为两类，分别是天疱疮和类天疱疮。天疱疮的诊断主要依赖于实验室对Desmoglein 1(Dsg1)和Desmoglein 3(Dsg3)自身抗体的检测。其中可疑天疱疮患者如果只检测到Dsg1的自身抗体就会被诊断为落叶型天疱疮，如果同时检测到Dsg1和Dsg3的自身抗体就会被诊断为寻常型天疱疮(Pemphigus vulgaris，PV)，如果只检测到Dsg3的自身抗体就会被诊断为黏膜优位的寻常型天疱疮。
[0003]现有的检测人Dsg3的IgG自身抗体的方法主要是免疫印迹法和ELISA法两种。免疫印迹法主要使用的是表皮抽提物作为抗原。表皮抽提物的制备过程非常复杂，目前全世界也只有非常专业的实验室才能制备，重组蛋白获得较容易，但是费用较高，最关键的问题是免疫印迹的方法比较复杂，不适宜在临床进行广泛应用。目前的商品化的检测Dsg3 IgG自身抗体的ELISA试剂盒因其只针对Dsg3的胞外区进行检测，这个区域被认为是寻常型天疱疮患者血清中的自身抗体主要识别的区域。但是，近期发现，一些天疱疮患者体内还存在着识别Dsg3胞内区的抗体，而目前商品化识别Dsg3 IgG抗体检测试剂盒对识别Dsg3其它区域的抗体无法检出，会出现假阴性的情况，从而影响患者的诊断及后续的治疗，不能满足未来天疱疮的诊断需求。
[0004]有鉴于此，本专利技术提出了一种新型的Dsg3 IgG抗体检测ELISA试剂盒，该试剂盒能够对识别Dsg3全长的全部抗原表位的抗体进行检测，提高了自身抗体的检出率，进而提高了临床上对天疱疮的诊断准确性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种用于检测人Dsg3 IgG抗体的ELISA试剂盒及其应用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0007]本专利技术的一种用于检测人Dsg3 IgG抗体的ELISA试剂盒，所述的试剂盒中含有Dsg3微孔条带，所述的Dsg3微孔条带中分别包被有SEQ ID NO.1
‑
20所示的多肽或所述多肽的混合物。
[0008]其中，优选的，所述的试剂盒中还含有标准血清1和2、酶标抗体、稀释液、反应缓冲液、清洗缓冲液、酶基质液以及终止液。
[0009]其中，优选的，所述的标准血清1为含0.05％叠氮钠w/v的反应缓冲液；所述的标准血清2为含有100U/ml的Dsg3 IgG抗体以及0.05％w/v叠氮钠的反应缓冲液；所述的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体；所述的反应缓冲液为含0.05％v/v Tween20和0.05％w/vNaN3的1xPBS，所述的清洗缓冲液为含0.5％v/vTween20的10xPBS；所述的酶基质液为TMB显色液；所述的终止液为0.5N盐酸溶液。
[0010]其中，优选的，所述的含有Dsg3微孔条带通过以下方法制备得到：
[0011]1)将SEQ ID NO.1
‑
20所示的多肽分别用PBS溶解，得到储存浓度为4mg/ml的多肽溶液，所有溶解后的多肽等体积混合，获得4mg/ml的多肽混合物，包被前使用PBS进行1000倍稀释，使得多肽混合物的终浓度达到4μg/ml；取96孔板进行抗原多肽的包被，每孔加入多肽混合物100μl，4℃进行包被12
‑
16h；或
[0012]2)将SEQ ID NO.1
‑
20所示的多肽分别用PBS溶解，得到储存浓度为4mg/ml的多肽溶液，包被前分别使用PBS进行1000倍稀释，使得多肽的终浓度达到4μg/ml；取96孔板进行抗原多肽的包被，每孔分别加入一种多肽溶液100μl，4℃进行包被12
‑
16h。
[0013]本专利技术的一种人Dsg3的IgG抗体检测试剂盒(ELISA)，利用ELISA方法定性测定血清中的Dsg3的IgG抗体。检测时，患者血清和标准血清加入到包被有Dsg3抗原多肽的微孔条带，Dsg3的IgG抗体与抗原结合。洗涤后，去除未结合的血清蛋白，然后微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体与人IgG结合，洗涤后，加入辣根过氧化物酶底物与辣根过氧化物酶反应，最后通过加入酸溶液终止酶反应。使用酶标仪测定吸光度，量化检测结果。
[0014]其中，优选的，所述的用于检测人Dsg3 IgG抗体时，按照以下步骤进行：
[0015](1)试剂准备
[0016]实验前，将所有检测材料置于室温下(20
‑
30℃)，根据需要用蒸馏水稀释适量的清洗缓冲液；
[0017](2)样本准备
[0018]1:50稀释每个患者血清：10μl血清加500μl反应缓冲液，混匀；
[0019](3)检测步骤
[0020]1)微孔条带加入100μl稀释后样本，室温下孵育60分钟；
[0021]2)洗涤微孔条带：使用200μl/孔稀释后的清洗缓冲液，洗涤4次；
[0022]3)加入100μl/孔酶标记抗体液，室温下孵育45分钟；
[0023]4)洗涤微孔条带：使用200μl/孔稀释后的清洗缓冲液，洗涤4次；
[0024]5)加入100μl/孔酶基质液，室温下孵育30分钟；
[0025]6)加入100μl/孔终止液；
[0026]7)读取吸光度(450nm)；
[0027]8)结果计算和判定
[0028]单位值(U/ml)计算公式：
[0029](A
450
<样品>
‑
A
450
<标准血清1>)*100/(A
450
<标准血清2>
‑
A
450
<标准血清1>)
[0030]判定标准：单位值<21为阴性；单位值≥21为阳性。
[0031]质量控制：每个检测结果必须符合下列条件，否则结果无效：
[0032]标准血清1的OD450小于等于0.100
[0033]标准血清2的OD450大于等于0.500。
[0034]进一步的，本专利技术还提出了所述的ELISA试剂盒在制备检测Dsg3 IgG抗体的试剂中的用途。
[0035]相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0036]1)本专利技术利用多个Dsg3抗原多肽来替代全长片段的完整蛋白作为ELISA的包被蛋白，在充分保障了抗体识别的抗原表位的同时，节约了大量的成本；若合成人Dsg3的全长蛋
白，或者分几段进行合成，然后混合在一起使用，作为包被蛋白，进行ELI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测人Dsg3 IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有Dsg3微孔条带，所述的Dsg3微孔条带中分别包被有SEQ ID NO.1
‑
20所示的多肽或是所述多肽的混合物。2.如权利要求1所示的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有标准血清1和2、酶标抗体、稀释液、反应缓冲液、清洗缓冲液、酶基质液以及终止液。3.如权利要求1所示的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的标准血清1为含0.05％叠氮钠w/v的反应缓冲液；所述的标准血清2为含有100U/ml的Dsg3 IgG抗体以及0.05％w/v叠氮钠的反应缓冲液；所述的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体；所述的反应缓冲液为含0.05％v/v Tween20和0.05％w/vNaN3的1xPBS，所述的清洗缓冲液为含0.5％v/vTween20的10xPBS；所述的酶基质液为TMB显色液；所述的终止液为0.5N盐酸溶液。4.如权利要求1所示的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的含有Dsg3微孔条带通过以下方法制备得到：1)将SEQ ID NO.1
‑
20所示的多肽分别用PBS溶解，得到储存浓度为4mg/ml的多肽溶液，所有溶解后的多肽等体积混合，获得4mg/ml的多肽混合物，包被前使用PBS进行1000倍稀释，使得多肽混合物的终浓度达到4μg/ml；取96孔板进行抗原多肽的包被，每孔加入多肽混合物100μl，4℃进行包被12
‑
16h；或2)将SEQ ID NO.1
‑
20所示的多肽分别用PBS溶解，得到储存浓度为4mg/ml的多肽溶液，包被前分别使用PBS进行1000倍稀释，使得多肽的终浓度达到4μg/ml；取96孔...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱华，李小光，
申请(专利权)人：钱华，
类型：发明
国别省市：