一种用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法技术

本发明专利技术涉及用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法，有效解决光学显微镜或扫描电子显微镜容易的对艾叶下表面的气孔、腺毛和非腺毛的分布以及表皮细胞的垂周壁式样进行观察的问题，新鲜艾叶涂胶，剥离下表面的非腺毛，取小块叶片，蒸馏水漂洗除去残胶，一部分叶片用甲醇固定，无水酒精脱水，乙酸异戊酯浸泡，二氧化碳临界点干燥，离子仪喷金，用于扫描电镜制片观察；另一部分小块叶片用氢氧化钠和次氯酸钠混合液浸泡，解离叶肉组织并漂白，清水漂洗，放在载玻片上，甲苯胺蓝O染色，碘化钠溶液透明，水封片，即成用普通光学显微镜或荧光显微镜观察气孔和表皮细胞的光学显微镜片。本发明专利技术操作简单，成本低，工作量小，成功率高，观察清晰，效果好。果好。果好。

【技术实现步骤摘要】
一种用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法


[0001]本专利技术涉及生药显微鉴定领域，特别是对植物艾叶下表面进行处理，从而可以对叶表皮特征进行观察的一种用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法。

技术介绍

[0002]艾叶为常用中药，全国大部分地区都产。艾叶晒干捣碎得“艾绒”，用于制艾条供艾灸用。艾叶表面的一些特征如毛被的类型和密度、气孔类型、气孔指数、表皮细胞的垂周壁式样等不仅对于艾叶的鉴定有重要的参考价值，同时对研究其植物生态、植物生理及品种选育也有重要的作用。艾叶上表面分布有腺毛和稀疏的非腺毛，用扫描电镜对对上表面进行观察比较容易；而下表面密被厚重的非腺毛，而非腺毛并覆盖了其下分布的腺毛、气孔和表皮细胞，因此使用扫描电子显微镜对下表面的显微特征进行观察就非常困难。用光学显微镜观察叶表面特征通常采用的制片法有撕取表皮法、解离表皮法、透明制片法，然而，由于艾叶为纸质叶，叶片薄，其上、下表面密布的腺毛又处于凹陷处，使得撕取表皮法和解离表皮法难以实施，单纯的透明制片法也因艾叶下表面密被厚重的非腺毛而难以看清气孔和表皮细胞等显微特征。由于现有制片技术的制约，目前无论是扫描电子显微镜还是光学显微镜都难以较好的观察艾叶下表面的气孔、腺毛和非腺毛分布以，及表皮细胞的垂周壁式样等显微特征。因此非常需要设计一种专门的制片方法来观察艾叶下表面的特征，但至今未见有公开报导。

技术实现思路

[0003]针对上述情况，为克服现有技术之不足，本专利技术之目的就是提供一种用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法，可有效解决光学显微镜或扫描电子显微镜容易的对艾叶下表面的气孔、腺毛和非腺毛的分布以及表皮细胞的垂周壁式样进行观察的问题。
[0004]本专利技术解决的技术方案是，一种用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法，包括以下步骤：（1）叶片涂胶：取新鲜的艾叶片，在叶片背面要取材料的部位均匀涂上一薄层中性胶与陶瓷胶的混合物，中性胶与陶瓷胶的体积比为2︰1，于混合胶上粘一纸条，轻压，确保粘贴牢固；（2）剥离非腺毛：混合胶干燥后，撕下纸条，下表面的非腺毛从下表面上剥离开，被沾在纸条上；（3）除去残余混合胶：在非腺毛被剥离的位置，切取6～8mm见方的小块叶片，转入蒸馏水中漂洗，反复漂洗3～5次，除去叶片上残余的混合胶，得干净的小块叶片；（4）制备扫描电镜：将干净的小块叶片分为两部分，一部分用甲醇室温固定6～12h，转入无水酒精脱水1h，用乙酸异戊酯处理浸泡10～20min，二氧化碳临界点干燥，离子仪喷金，用于扫描电镜制片观察，另一部分用于光学显微镜制片；（5）光学显微镜制片：将剩余的另一部分小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度5%～
10%的氢氧化钠和5%～10%次氯酸钠混合液中，室温浸泡6～12h，解离叶肉组织，同时漂白；（6）染色：将叶片从混合液中取出，在清水中漂洗1～3min，放在载玻片上，在上方滴加一滴（约0.02ml）甲苯胺蓝O溶液染色1～3min；所述的甲苯胺蓝O溶液为，甲苯胺蓝O用pH4.0的磷酸盐缓冲液溶解制成，甲苯胺蓝O的质量浓度0.1%～0.5%；（7）叶片取出后用40%～60%的碘化钠溶液室温透明0.5～1h，用盖玻片水封片后，即成用普通光学显微镜或荧光显微镜观察气孔和表皮细胞的光学显微镜片。
[0005]本专利技术具有操作简单，成本低，工作量小，成功率高，观察清晰，效果好的特点，可有效解决艾叶表面观察的技术难题，对操作人员技术要求低，是显微观察艾叶下表面特征制片上的一大创新。
附图说明
[0006]图1为本专利技术荧光显微镜下观察图，艾叶下表皮气孔、非腺毛毛基（白三角）和腺毛（白箭头），低倍镜下用于观察和计数。
[0007]图2为本专利技术亮视野显微镜下观察艾叶下表皮气孔、表皮细胞和非腺毛毛基（箭头）图。
[0008]图3为本专利技术脱毛后扫描电镜下观察艾叶下表面图。
具体实施方式
[0009]以下结合具体情况和实施例对本专利技术的具体实施方式作详细说明。
[0010]本专利技术在具体实施中可由以下实施例给出。
[0011]实施例1本专利技术一种用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法，包括以下步骤：（1）叶片涂胶：取新鲜的艾叶片，在叶片背面要取材料的部位均匀涂上一薄层中性胶与陶瓷胶的混合物，中性胶与陶瓷胶的体积比为2︰1，于混合胶上粘一纸条，轻压，确保粘贴牢固；（2）剥离非腺毛：混合胶干燥后，撕下纸条，下表面的非腺毛从下表面上剥离开，被沾在纸条上；（3）除去残余混合胶：在非腺毛被剥离的位置，切取7mm见方的小块叶片，转入蒸馏水中漂洗，反复漂洗4次，除去叶片上残余的混合胶，得干净的小块叶片；（4）制备扫描电镜：将干净的小块叶片分为两部分，一部分用甲醇室温固定9h，转入无水酒精脱水1h，用乙酸异戊酯处理浸泡15min，二氧化碳临界点干燥，离子仪喷金，用于扫描电镜制片观察，另一部分用于光学显微镜制片；（5）光学显微镜制片：将剩余的另一部分小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度7.5%的氢氧化钠和7.5%次氯酸钠混合液中，室温浸泡9h，解离叶肉组织，同时漂白；（6）染色：将叶片从混合液中取出，在清水中漂洗2min，放在载玻片上，在上方滴加一滴（约0.02ml）甲苯胺蓝O溶液染色2min，甲苯胺蓝O溶液的质量浓度0.3%；（7）叶片取出后用50%的碘化钠溶液室温透明0.7h，用盖玻片水封片后，即成用普通光学显微镜或荧光显微镜观察气孔和表皮细胞的光学显微镜片。
[0012]实施例2本专利技术一种用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法，包括以下步骤：（1）叶片涂胶：取新鲜的艾叶片，在叶片背面要取材料的部位均匀涂上一薄层中性胶与陶瓷胶的混合物，中性胶与陶瓷胶的体积比为2︰1，于混合胶上粘一纸条，轻压，确保粘贴牢固；（2）剥离非腺毛：混合胶干燥后，撕下纸条，下表面的非腺毛从下表面上剥离开，被沾在纸条上；（3）除去残余混合胶：在非腺毛被剥离的位置，切取6mm见方的小块叶片，转入蒸馏水中漂洗，反复漂洗3次，除去叶片上残余的混合胶，得干净的小块叶片；（4）制备扫描电镜：将干净的小块叶片分为两部分，一部分用甲醇室温固定6.5h，转入无水酒精脱水1h，用乙酸异戊酯浸泡20min，二氧化碳临界点干燥，离子仪喷金，用于扫描电镜制片观察，另一部分用于光学显微镜制片；（5）光学显微镜制片：将剩余的另一部分小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度6%的氢氧化钠和6%次氯酸钠混合液中，室温浸泡11.5h，解离叶肉组织，同时漂白；（6）染色：将叶片从混合液中取出，在清水中漂洗1min，放在载玻片上，在上方滴加一滴（约0.02ml）甲苯胺蓝O溶液染色1min，甲苯胺蓝O溶液的质量浓度0.5%；（7）叶片取出后用60%的碘化钠溶液室温透明0.5h，用盖玻片水封片后，即成用普通光学显微镜或荧光显微镜观察气孔和表皮细胞的光学显微镜片。
[0013]实施例3本专利技术一种用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法，包括以下步骤：（1）叶片涂胶：取新鲜的艾叶片，在叶片背面要取材料的部位均匀涂上一薄层中性胶与陶瓷胶的混合物，中性胶与陶瓷胶的体积比为2︰1，于混合胶上粘一纸条，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）叶片涂胶：取新鲜的艾叶片，在叶片背面要取材料的部位均匀涂上一薄层中性胶与陶瓷胶的混合物，中性胶与陶瓷胶的体积比为2︰1，于混合胶上粘一纸条，轻压，确保粘贴牢固；（2）剥离非腺毛：混合胶干燥后，撕下纸条，下表面的非腺毛从下表面上剥离开，被沾在纸条上；（3）除去残余混合胶：在非腺毛被剥离的位置，切取6～8mm见方的小块叶片，转入蒸馏水中漂洗，反复漂洗3～5次，除去叶片上残余的混合胶，得干净的小块叶片；（4）制备扫描电镜：将干净的小块叶片分为两部分，一部分用甲醇室温固定6～12h，转入无水酒精脱水1h，用乙酸异戊酯处理浸泡10～20min，二氧化碳临界点干燥，离子仪喷金，用于扫描电镜制片观察，另一部分用于光学显微镜制片；（5）光学显微镜制片：将剩余的另一部分小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度5%～10%的氢氧化钠和5%～10%次氯酸钠混合液中，室温浸泡6～12h，解离叶肉组织，同时漂白；（6）染色：将叶片从混合液中取出，在清水中漂洗1～3min，放在载玻片上，在上方滴加一滴甲苯胺蓝O溶液染色1～3min；所述的甲苯胺蓝O溶液为，甲苯胺蓝O用pH4.0的磷酸盐缓冲液溶解制成，甲苯胺蓝O的质量浓度0.1%～0.5%；（7）叶片取出后用40%～60%的碘化钠溶液室温透明0.5～1h，用盖玻片水封片后，即成用普通光学显微镜或荧光显微镜观察气孔和表皮细胞的光学显微镜片。2.本发明具有操作简单，成本低，工作量小，成功率高，观察清晰，效果好的特点，可有效解决艾叶表面观察的技术难题，对操作人员技术要求低，是显微观察艾叶下表面特征制片上的一大创新。3.根据权利要求1所述的用于观察艾叶下表面特征的显微制片方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）叶片涂胶：取新鲜的艾叶片，在叶片背面要取材料的部位均匀涂上一薄层中性胶与陶瓷胶的混合物，中性胶与陶瓷胶的体积比为2︰1，于混合胶上粘一纸条，轻压，确保粘贴牢固；（2）剥离非腺毛：混合胶干燥后，撕下纸条，下表面的非腺毛从下表面上剥离开，被沾在纸条上；（3）除去残余混合胶：在非腺毛被剥离的位置，切取7mm见方的小块叶片，转入蒸馏水中漂洗，反复漂洗4次，除去叶片上残余的混合胶，得干净的小块叶片；（4）制备扫描电镜：将干净的小块叶片分为两部分，一部分用甲醇室温固定9h，转入无水酒精脱水1h，用乙酸异戊酯处理浸泡15min，二氧化碳临界点干燥，离子仪喷金，用于扫描电镜制片观察，另一部分用于光学显微镜制片；（5）光学显微镜制片：将剩余的另一部分小块叶片置入体积比1︰1的质量浓度7.5%的氢氧化钠和7.5%次氯酸钠混合液中，室温浸泡9h，解离叶肉组织，同时漂白；（6）染色：将叶片从混合液中取出，在清水中漂洗2min，放在载玻片上，在上方滴加一滴甲苯胺蓝O溶液染色2min，甲苯胺蓝O溶液的质量浓度0.3%；（7）...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭涛，冯书营，雷青会，许二平，回成程，刘孟奇，张振强，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：