运动肌肉损伤相关线粒体检测位点、检测方法及应用技术

本发明专利技术属于运动肌肉损伤相关的线粒体致病位点检测技术领域，公开了运动肌肉损伤相关线粒体检测的12个位点组合，并采用对线粒体高度保守区域从两个方向分别扩增线粒体基因组，避免对核基因组携带的线粒体DNA相似序列的非特异扩增，获得能够覆盖线粒体全基因组的两个长片段。采用本发明专利技术提供的运动肌肉损伤相关线粒体检测位点为检测对象，并采用本发明专利技术提供的试剂盒，可判断对应的位点是否出现突变，如果携带线粒体致病性碱基突变，则提示在运动训练时存在肌肉损伤的易感倾向并提示预警。时存在肌肉损伤的易感倾向并提示预警。时存在肌肉损伤的易感倾向并提示预警。

【技术实现步骤摘要】
运动肌肉损伤相关线粒体检测位点、检测方法及应用


[0001]本专利技术属于运动肌肉损伤检测
，涉及一种运动肌肉损伤相关线粒体检测位点、检测方法及应用。

技术介绍

[0002]在大强度、高负荷的运动训练中可能导致肌纤维过度收缩或拉伸，产生损伤诱发肌肉细胞坏死、炎症细胞浸润，局部可发生炎症反应，机体产生乏力感、肌肉肿胀感、酸痛感，且较正常运动疲劳更难恢复。当肌肉损伤持续超出身体可恢复的范围时，可发生横纹肌溶解，并在外周循环中呈现出由损伤肌肉释放出来的物质，引起茶色尿甚至深色尿。肌肉成分释放到血液中后，可表现为肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌红蛋白(myoglobin)、α
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肌动蛋白(α
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actin)水平升高，在尿液中也可以检测到肌红蛋白。血清或血浆中肌酸激酶的水平是最常见的判定和诊断肌肉损伤程度的指标，CK数值超过1000U/L可确诊，或者通过血或尿中检测到肌红蛋白可确定，需要注意的是血清肌红蛋白升高也可能由急性心梗引起。因为肌酸激酶对肌肉损伤的指示作用，在运动训练和运动员状态监测中，常用来判断运动负荷和可能的运动损伤，在动物模型中也得到验证。不过这些都依赖于运动后发生了损伤现象才可以实施监测，并不能提前预警潜在的运动损伤风险。
[0003]发生横纹肌溶解时，由于循环中肌肉释放的蛋白大分子成分含量上升，造成肾脏负担加重，甚至引发肾衰以及威胁生命。因此，如果能通过已知可能引发横纹肌溶解这类肌肉损伤的风险进行预判，可以更早地对训练策略和训练相关的生化监测进行提示，避免出现严重的肌肉损伤甚至危及生命的不良结局。
[0004]造成运动肌肉损伤甚至横纹肌溶解的遗传因素包括线粒体的致病突变。线粒体中三羧酸循环为机体最重要的能量代谢途径，线粒体的致病突变可导致线粒体能量代谢和电子传递链功能异常。例如有文献报道人的线粒体基因组长约16.6kb，编码了37个基因都参与线粒体氧化呼吸链上蛋白的组装，其中13个基因编码呼吸酶复合物蛋白，22个基因编码不同的tRNA，2个编码rRNA。编码了细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase)复合物组分的COX I/II/III发生致病突变时，可导致运动或长时间运动诱导的横纹肌溶解。还有文献报道一名45岁男性带有ND1基因突变(m.3394T>C)表现出高肌红蛋白尿、乏力、血清CK水平升高并且出现肾衰，肌肉组织病理显示异常肌纤维表现，并且既往在竞技运动项目后出现过两次类似症状。这些都提示我们线粒体突变和横纹肌溶解相关，并进一步可以作为判断运动员横纹肌溶解及运动肌肉损伤的标准。
[0005]对于线粒体的致病突变位点，常见的检测方法有经典的Southern杂交、一代测序(单个检测序列覆盖800bp左右)、二代测序，也可以使用通用的SNP检测方法。在各类方法中，对线粒体扩增可选择常规PCR、定量PCR或者是长片段PCR。常规PCR一般扩增2kb以内的片段，定量PCR的目标片段更短，通常不超过300bp。长片段扩增甚至可以直接扩增整个线粒体序列，都可用于缺失序列检测。PCR扩增结合RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)也是研究中常用的突变检测方式。但是常规短片段扩增可能因为核基因组上和线粒体同源的序
列，造成检测的错误。核内的线粒体类似序列(NUMTs)广泛分布于各个染色体，部分和线粒体同源性可达94％以上，多数的相似度在68％至100％之间。而且大部分NUMTs的片段长度较短，为几十至200bp。因此短片段扩增或者扩增位置序列与NUMTs重合时，容易造成PCR扩增的偏倚和NUMT序列对线粒体序列的污染。
[0006]因此，目前在运动员肌肉损伤风险的判断尤其是在运动前就能实现运动肌肉损伤风险的判断是存在困难，急需一种能够精准有效判断运动员在训练前出现肌肉损伤风险的方法。

技术实现思路

[0007]为了克服上述技术问题，本专利技术提供了一种运动肌肉损伤相关线粒体检测位点的集合，以及该检测位点集合的检测方法。本专利技术对一组训练后出现横纹肌溶解的新学员进行线粒体测序发现，在这组样本中携带有12个线粒体致病突变，并通过本专利技术的检测方法，快速准确地实现了运动员在运动前肌肉损伤风险的预判。
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种运动肌肉损伤相关线粒体检测位点，所述检测位点由线粒体DNA中3394T>C、3421A>G、4833A>G、5814T>C、8108A>G、8363G>A、9957T>C、12338T>C、14484A>G、14502T>C、14693A>G、15927G>A组成。其中，所述线粒体序列为已知人线粒体基因组序列(NC_012920.1)。
[0009]第二方面，本专利技术还提供了一种检测本专利技术第一方面所述线粒体检测位点的引物组，所述引物组包括线粒体长片段扩增引物及一步延伸引物。
[0010]更进一步地，所述线粒体长片段扩增引物包括扩增引物组合1及扩增引物组合2，所述扩增引物组合1包括扩增上游引物SEQ ID NO.1及扩增下游引物SEQ ID NO.2，所述扩增引物组合2包括扩增上游引物SEQ ID NO.3及扩增下游引物SEQ ID NO.4。
[0011]更进一步地，所述一步延伸引物的序列如SEQ ID NO.5
‑
16所示。
[0012]第三方面，本专利技术还提供了一种检测运动肌肉损伤相关线粒体位点的试剂盒，其包括至少一次用量的权利要求2
‑
4任一所述的引物组。
[0013]第四方面，本专利技术还提供了一种筛查样本出现运动肌肉损伤的方法，所述方法用于非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，所述方法包括，采用本专利技术第一方面所述的引物组或者本专利技术第二方面所述的试剂盒对样本进行检测，并与对照样本比较，以筛查出现运动肌肉损伤的样本。
[0014]更进一步地，所述比较是指与对照样本相比是否出现线粒体DNA突变位点，如果出现所述线粒体DNA突变位点，则样本出现运动肌肉损伤的风险相对较大。
[0015]更进一步地，所述线粒体DNA突变位点为3394T>C、3421A>G、4833A>G、5814T>C、8108A>G、8363G>A、9957T>C、12338T>C、14484A>G、14502T>C、14693A>G、15927G>A。
[0016]本专利技术相对于现有技术具有的技术效果：
[0017]1)本专利技术发现的线粒体致病位点组合，在运动训练之前进行检测，可以有效预判其出现运动肌肉损伤的风险，为线粒体致病突变相关的肌病表现给予预警提示。
[0018]2)本专利技术选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种运动肌肉损伤相关线粒体检测位点，其特征在于，所述检测位点由线粒体DNA中3394T>C、3421A>G、4833A>G、5814T>C、8108A>G、8363G>A、9957T>C、12338T>C、14484A>G、14502T>C、14693A>G、15927G>A组成。2.一种检测权要要求1所述线粒体检测位点的引物组，其特征在于，所述引物组包括线粒体长片段扩增引物及一步延伸引物。3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述线粒体长片段扩增引物包括扩增引物组合1及扩增引物组合2，所述扩增引物组合1包括扩增上游引物SEQ ID NO.1及扩增下游引物SEQ ID NO.2，所述扩增引物组合2包括扩增上游引物SEQ ID NO.3及扩增下游引物SEQ ID NO.4。4.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述一步延伸引物的序列如SEQ ID NO.5
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16所示。5.一种检测运...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉栩，杨广明，姚咏明，陈宁，田亚平，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：