一种在胃癌中高表达的潜在促癌基因(HOXC10)，能够促进胃癌细胞的侵袭和转移。发明专利技术了四对shRNA及重组慢病毒，可化学合成，具有沉默HOXC10表达效率高，对胃癌有潜在治疗作用。用。
【技术实现步骤摘要】
HOXC10在胃癌发病机制中的作用
[0001]本文专利技术涉及基因表达在癌症发病机制中的作用，特别是涉及胃癌。
技术介绍
[0002]胃癌(Gastric Cancer)是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，据统计，我国2015年胃癌新增发病人数大约68万人，病死人数大约50万，居恶性肿瘤第二位，其死亡率在男性中仅次于肺癌，在女性中仅次于乳腺癌。目前胃癌仍以手术治疗为首选。随着医疗技术水平的提高，内镜下早期诊断率较前明显提高并可及时进行相应治疗，但若发生肿瘤转移，往往导致手术难以进行而只能接受姑息治疗。同源盒(Homeobox) 基因是一个调节基因家族，编码有转录因子作用的特异性核蛋白(Homeoprotein，同源盒蛋白)。HOXC10 是HOX家族中的一员，HOXC10定位于人类染色体12q13.13，其同源决定簇负责识别并结合特异序列的 DNA基序，进而激活或抑制下游目的基因表达，控制器官发生与细胞分化。近年来，研究报道HOXC10 在骨肉瘤、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、宫颈癌等肿瘤中可促进转移、抑制凋亡等。迄今，HOXC10在胃癌恶性发展中的生物学功能、分子机制及表观遗传学等研究仍较为缺乏。
技术实现思路
[0003]本专利技术发现了HOXC10在胃癌中表达增高，具有促进侵袭、转移的作用，并且专利技术了四对shRNA，可化学合成，具有沉默HOXC10表达效率高，对胃癌有潜在治疗作用。
具体实施方式
[0004]1.细胞株体外培养(Cell Culture)
[0005]1.1.相关试剂与仪器
[0006]1.1.1.试剂
[0007]DMEM、RPMI 1640、KSFM、胰酶、FBS、PBS。
[0008]1.1.2.培养相关仪器与耗材
[0009]生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养瓶、细胞培养皿、细胞培养板、冻存管、枪头。
[0010]1.2.方法
[0011]正常人胃粘膜细胞GES-1采用含10％FBS的KSFM培养液于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养；胃癌细胞株AGS、MKN28、NCI-N87、MGC803均采用含10％FBS的RPMI 1640培养液于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养；胃癌细胞株HGC27、MKN45、SGC7901均采用含10％FBS的DMEM培养液于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。每天观察细胞形态变化，每隔1天进行细胞换液，待细胞密度达到85％-90％后，在生物安全柜中遵循无菌操作使用0.25％的胰酶进行细胞消化传代。
[0012]2.免疫印迹(Western Blotting；WB)
[0013]2.1.相关试剂与仪器
[0014]2.1.1.抗体
[0015]HOXC10、ATM、p-ATM、IκBα、p-IκBα、α-tubulin、鼠与兔二抗。
[0016]2.1.2.试剂与仪器
[0017]Glycine、Tris base、SDS、Methanol、RIPA缓冲液、Tween-20、脱脂奶粉、Glycerine、Gromophenol Blue、 DTT、甘氨酸、β-巯基乙醇、甲醇、ECL发光液、蛋白酶抑制剂PMSF、BCA Protein Assay kit、低温超速离心机(Eppendorf公司)、分光光度计(Eppendorf公司)、Thermomixer(Eppendorf公司)、SDS-PAGE 蛋白电泳仪(Bio-Rad公司)、垂直式电泳槽(Bio-Rad公司)、硝酸纤维素膜电转系统(Bio-Rad公司) 等。
[0018]2.2.实验方法与步骤
[0019]2.2.1.细胞总蛋白的提取、纯化
[0020]2.2.1.1.待细胞生长至80％-90％时开始收取蛋白。将细胞置于冰盒上从培养房转运至实验室；
[0021]2.2.1.2.弃培养瓶内培养基及血清，并将培养板倒扣在吸水纸上吸干剩余培养液；
[0022]2.2.1.3.加入1
×
PBS轻轻漂洗细胞2-3次，除去细胞表面的残留血清；
[0023]2.2.1.4.弃漂洗液并尽量除尽，根据细胞数及培养瓶皿适量加入1
×
Sample Buffer，裂解细胞；
[0024]2.2.1.5.用干净的刮子刮下细胞，此时可见粘稠糊状物质；
[0025]2.2.1.6.将上述糊状物质转移到1.5ml EP管中。用1ml注射器反复抽吸样品，直至水样澄清；
[0026]2.2.1.7.离心去沉渣(5min 5000rpm)；
[0027]2.2.1.8.置入-20℃冰箱保存，或即刻定量变性。
[0028]2.2.2.组织总蛋白的提取、纯化
[0029]2.2.2.1.液氮碾磨组织；
[0030]2.2.2.2.根据组织块大小加入适量的1
×
Sample Buffer；
[0031]2.2.2.3.将收集的总蛋白装入1.5ml EP管，1ml注射器反复抽吸样本至水样澄清；
[0032]2.2.2.4.离心(10000rpm，10min，4℃)，取上清；
[0033]2.2.2.5.置入-20℃保存或即刻变性定量。
[0034]2.2.3.蛋白浓度测定
[0035]2.2.3.1.按下表的要求配制标准品：BSA原液为2.0mg/ml，用PBS进行稀释；
[0036][0037]2.2.3.2.配制工作液：根据标准品和待测样品的数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1) 配制适量的BCA工作液，充分混匀；
[0038]2.2.3.3.按需要将25μl的标准品或待测样品添加到96孔板的微孔中，再分别加入200μl BCA工作液，轻敲96孔板使其充分混匀。
[0039]2.2.3.4.将96孔板放入37℃培养箱孵育30min后拿出冷却至室温；
[0040]2.2.3.5.用酶标仪测量标准蛋白与样本的A562的吸光值；
[0041]2.2.3.6.据测量的A562的吸光值与标准蛋白浓度值，利用Excel制定标准曲线，计算蛋白样本浓度。
[0042]2.2.4.免疫印迹
[0043]2.2.4.1.蛋白变性：将配置好的蛋白样品中放入沸水中加热5-8分钟；
[0044]2.2.4.2.配胶：配好含有5％的浓缩胶、10％的分离胶的SDS-PAGE胶；
[0045]2.2.4.3.做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡；
[0046]2.2.4.4.上样、电泳：上层胶为安全凝固(大约15min)后，两只手同时向上用力取下梳子。以一定顺序将蛋白样品和Marker，用微量移液枪加至泳道。调整浓缩胶的分离电压为80V左右，待蛋白预染染marker 出现后调整分离胶的分离电本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种(共四个)重组慢病毒载体人源HOXC10沉默shRNA，将它们分别命名为HOXC10 sh#1、HOXC10 sh#2、HOXC10 sh#3和HOXC10 sh#4。其干扰序列为：HOXC10 sh#1：CCGGCGCTCTAAGAATCTGCTTGAACTCGAGTTCAAGCAGATTCTTAGAGCGTTTTT；HOXC10 sh#2：CCGGCTGGAGATTAGCAAGACCATTCTCGAGAATGGTCTTGCTAATCTCCAGTTTTT；HOXC10 sh#3：CCGGACCTCGGATAACGAAGCGAAACTCGAGTTTCGCTTCGTTATCCGAGGTTTTTT；HOXC10 sh#4：CCGGACCTAGTGTCAAGGAGGAGAACTCGAGTTCTCCTCCTTGACACTAGGTTTTTT。一种重组慢病毒载体人源HOXC10基因亚克隆。酶切位点：SgfI/MluI载体标签：C端融合Flag&His标签测序引物：5
’
端测序引物(EF1a Seq_01)：GAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTG3<...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱森林，姚声，张译，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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