一种非人哺乳动物或其子代的制备方法及其应用技术

本发明专利技术实施例涉及一种非人哺乳动物或其子代的制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：使得非人哺乳动物体内不表达或不正确表达IgM重链恒定区CH1结构域的步骤；以及，使得非人哺乳动物体内一个、两个、三个、四个或四个以上编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤。所得非人哺乳动物或其子代可以用于生产重链抗体。采用本发明专利技术实施例制备方法获得的非人哺乳动物不引入任何编码抗体重链可变区和恒定区的外源基因，可以直接利用其自身基因组中编码抗体重链可变区的所有VDJ基因，从而通过重链可变区重排产生多样性更好的重链抗体。产生多样性更好的重链抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种非人哺乳动物或其子代的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种非人哺乳动物或其子代的制备方法及其应用，该非人哺乳动物或其子代可以用于生产重链抗体。

技术介绍

[0002]抗体是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)通过链间非共价键或二硫键连接而成的四条肽链结构。抗体重链包括重链恒定区(C
H
)和重链可变区(V
H
)；其中：IgD、IgG、IgA的重链恒定区包括4个结构域：CH1，铰链区Hinge，CH2，CH3；IgM和IgE包括4个结构域：CH1，CH2，CH3，CH4(Janeway
’
s Immunobiology，9
th Edition)；重链恒定区的CH1结构域通过二硫键与轻链恒定结构域进行连接；重链可变区包括互补决定区(CDR)的高度可变区和相对保守的、称为框架区(FR)的区域中，重链可变区包括3个CDR和4个FR，从氨基端至羧基端依下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0003]根据抗体重链恒定区抗原特异性的不同，抗体包括以下5类：IgM、IgD、IgG、IgE、IgA。同一类抗体因其重链恒定区内抗原特异性仍有某些差异，所以又可将它们分为若干亚类，如：人IgG包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等；人IgA包括IgA1、IgA2等；不同哺乳动物之间(如人、羊驼和小鼠)、不同品系的小鼠之间(如C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠)的抗体的亚类种类可能不同。
[0004]与抗体重链相关的基因包括L、V、D、J、C五类基因片段，其中：重链可变区由V、D、J三种基因片段编码，重链恒定区由C基因片段编码。人的抗体重链基因中包括有功能的约40个V基因、23个D基因、6个J基因以及9个C基因(来源：Janeway
’
s Immunobiology，9
th Edition，Page 177)。编码IgM重链恒定区的基因为Ighm基因(Immunoglobulin heavy constant mu)，编码IgD重链恒定区的基因为Ighd基因(Immunoglobulin heavy constant delta)，编码IgG重链恒定区的基因为Ighg(Immunoglobulin heavy constant gamma)，编码IgA重链恒定区的基因为Igha(Immunoglobulin heavy constant alpha)等；相应的，编码IgG1重链恒定区的基因为Ighg1(Immunoglobulin heavy constant gamma 1)，编码IgG3重链恒定区的基因为Ighg3(Immunoglobulin heavy constant gamma 3)，编码IgG2b重链恒定区的基因为Ighg2b(Immunoglobulin heavy constant gamma 2b)。通过重链可变区重排产生具有多样性的抗体。成熟B细胞经抗原刺激后生成分泌型抗体IgM，再次抗原刺激后会发生第二次重排，膜上表达和分泌的免疫球蛋白的种类会从亲和力较低的IgM转换成亲和力高的IgG、IgA、IgE等其他类别或亚类的免疫球蛋白，这种现象称为类别转换(Class switch)或同种型转换(Isotype switch)。
[0005]重链抗体(heavy chain antibody)，也叫仅有重链的抗体(heavy chain only antibody)，是指仅由两条重链组成的免疫球蛋白抗体。天然存在的重链抗体存在于自然界骆驼科动物和鲨鱼体内。骆驼科动物胚系中的重链基因座包含编码重链恒定区的基因片段，在成熟期间，经重排的VDJ结合区被剪接到编码IgG铰链区的基因片段的5
’
末端，从而使得其缺乏介导与轻链结合的CH1区而不能与轻链结合，产生IgG2和IgG3重链抗体。利用基因
修饰动物的方法也能生成重链抗体，对生成的重链抗体分类的方式也是根据抗体重链恒定区抗原特异性的不同。
[0006]与传统抗体的分子量(150-160kDa)相比，重链抗体要小得多，IgG2c重链抗体一条重链大约40kDa，其决定抗原识别特异性的重链可变区只有约15kDa。重链抗体的特点是分子量小，能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点。
[0007]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0008]专利技术目的
[0009]本专利技术的目的在于提供一种非人哺乳动物或其子代的制备方法及其应用。
[0010]解决方案
[0011]为实现本专利技术目的，本专利技术实施例提供了以下技术方案：
[0012]本专利技术实施例的第一方面，提供了一种非人哺乳动物或其子代的制备方法，其包括以下步骤：
[0013]使得非人哺乳动物体内不表达或不正确表达IgM重链恒定区CH1结构域的步骤；
[0014]以及，使得非人哺乳动物体内一个、两个、三个、四个或四个以上编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤。
[0015]上述制备方法在一种可能的实现方式中，使得非人哺乳动物体内不表达或不正确表达IgM重链恒定区CH1结构域的步骤为：
[0016]仅使得非人哺乳动物体内不表达或不正确表达IgM重链恒定区CH1结构域的步骤；
[0017]或，使得非人哺乳动物体内不表达或不正确表达IgM重链恒定区和IgD重链恒定区的步骤。
[0018]上述制备方法在一种可能的实现方式中，使得非人哺乳动物体内一个、两个、三个、四个或四个以上编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤为：
[0019]使得非人哺乳动物体内第一个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；
[0020]或，使得非人哺乳动物体内第一个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达其所编码的IgG重链恒定区、并且使得非人哺乳动物体内第二个或第三个或第四个编码IgG重链恒定区的基因中的一个、两个或三个在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；
[0021]或，使得非人哺乳动物体内第一个和第二个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达其所编码的IgG重链恒定区、并且使得非人哺乳动物体内第三个或第四个编码IgG重链恒定区的基因中的一个或两个在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；
[0022]或，使得非人哺乳动物体内第一个和第二个和第三个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达其所编码的IgG重链恒定区、并且使得非人哺乳动物体内第四个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；
[0023]或，使得非人哺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非人哺乳动物或其子代的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：使得非人哺乳动物体内不表达或不正确表达IgM重链恒定区CH1结构域的步骤；以及，使得非人哺乳动物体内一个、两个、三个、四个或四个以上编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：使得非人哺乳动物体内不表达或不正确表达IgM重链恒定区CH1结构域的步骤为：仅使得非人哺乳动物体内不表达或不正确表达IgM重链恒定区CH1结构域的步骤；或，使得非人哺乳动物体内不表达或不正确表达IgM重链恒定区和IgD重链恒定区的步骤。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：使得非人哺乳动物体内一个、两个、三个、四个或四个以上编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤为：使得非人哺乳动物体内第一个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；或，使得非人哺乳动物体内第一个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达其所编码的IgG重链恒定区、并且使得非人哺乳动物体内第二个或第三个或第四个编码IgG重链恒定区的基因中的一个、两个或三个在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；或，使得非人哺乳动物体内第一个和第二个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达其所编码的IgG重链恒定区、并且使得非人哺乳动物体内第三个或第四个编码IgG重链恒定区的基因中的一个或两个在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；或，使得非人哺乳动物体内第一个和第二个和第三个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达其所编码的IgG重链恒定区、并且使得非人哺乳动物体内第四个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；或，使得非人哺乳动物体内第一个编码IgG重链恒定区的基因在表达时正确表达其所编码的IgG重链恒定区、并且使得非人哺乳动物体内第二个或第三个或第四个编码IgG重链恒定区的基因中的一个、两个或三个在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；或，使得非人哺乳动物体内第一个和第二个编码IgG重链恒定区的基因在表达时正确表达其所编码的IgG重链恒定区、并且使得非人哺乳动物体内第三个或第四个编码IgG重链恒定区的基因中的一个或两个在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤；或，使得非人哺乳动物体内第一个和第二个和第三个编码IgG重链恒定区的基因在表达时正确表达其所编码的IgG重链恒定区、并且使得非人哺乳动物体内第四个编码IgG重链恒定区的基因在表达时不表达或不正确表达CH1结构域的步骤。4.一种非人哺乳动物或其子代的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：敲除非人哺乳动物基因组上的、包括编码IgM重链恒定区CH1结构域的核苷酸序列的步骤；以及，敲除以下目标基因的步骤，所述目标基因包括：一个、两个、三个、四个或四个以上编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：敲除非人哺乳动物基因组上的、包括编码IgM重链恒定区CH1结构域的核苷酸序列的步骤为：仅敲除非人哺乳动物基因组上的、编码IgM重链恒定区CH1结构域的核苷酸序列的步骤；或，敲除非人哺乳动物基因组上的、编码IgM重链恒定区和IgD重链恒定区的步骤。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述目标基因为：第一个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列；或，从第一个编码IgG重链恒定区的基因开始至第二个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列的全部核苷酸序列；或，从第一个编码IgG重链恒定区的基因开始至第三个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列的全部核苷酸序列；或，从第一个编码IgG重链恒定区的基因开始至第四个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列的全部核苷酸序列；或，从第一个编码IgG重链恒定区的基因开始至最后一个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列的全部核苷酸序列；或，第二个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列；或，从第二个编码IgG重链恒定区的基因开始至第三个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列的全部核苷酸序列；或，从第二个编码IgG重链恒定区的基因开始至第四个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列的全部核苷酸序列；或，第三个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列；或，从第三个编码IgG重链恒定区的基因开始至第四个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列的全部核苷酸序列；或，第四个编码IgG重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列。7.根据权利要求4-6之一所述的制备方法，其特征在于：以下步骤在同一操作步骤中完成或在不同的操作步骤中完成：敲除非人哺乳动物基因组上的、包括编码IgM重链恒定区CH1结构域的核苷酸序列的步骤；敲除目标基因的步骤。8.根据权利要求1-7之一所述的制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为啮齿类动物；可选地，所述啮齿类动物为大鼠或小鼠；进一步可选地，所述啮齿类动物为小鼠；更进一步，所述小鼠为C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠。9.根据权利要求3、6、7或8所述的制备方法，其特征在于：第一个编码IgG重链恒定区的基因为Ighg3。10.根据权利要求3、6、7、8或9所述的制备方法，其特征在于：当非人哺乳动物为C57BL/6小鼠时，第一个编码IgG重链恒定区的基因为Ighg3、第二个编码IgG重链恒定区的基因Ighg1、第三个编码IgG重链恒定区的基因Ighg2b、第四个编码IgG重链恒定区的基因Ighg2c；当非人哺乳动物为BALB/c小鼠时，第一个编码IgG重链恒定区的基因为Ighg3、第二个
编码IgG重链恒定区的基因Ighg1、第三个编码IgG重链恒定区的基因Ighg2b、第四个编码IgG重链恒定区的基因Ighg2a。11.根据权利要求1-10之一所述的制备方法，其特征在于：所述非人哺乳动物基因组上包括完整的编码κ轻链和/或λ轻链的基因；可选地，所述非人哺乳动物中能正常表达κ轻链和/或λ轻链。12.根据权利要求1-10之一所述的制备方法，其特征在于：基因敲除的方法包括以下的一种或几种：基因打靶技术、CRISPR/Cas9方法、锌指核酸酶方法、转录激活子样效应因子核酸酶方法。13.根据权利要求1-10之一所述的制备方法，其特征在于：所述非人哺乳动物或其子代用于生产重链抗体。14.一种C57BL/6小鼠或其子代的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：敲除C57BL/6小鼠的基因组中编码抗体IgM重链恒定区和IgD重链恒定区的基因的步骤；以及，敲除C57BL/6小鼠的基因组中从编码IgG3重链恒定区的基因开始至编码IgG2c重链恒定区的基因上的、编码CH1结构域的核苷酸序列的步骤。15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于：所述C57BL/6小鼠基因组中包括完整的编码κ轻链和/或λ轻链的基因；可选地，所述C57BL/6小鼠能正常表达κ轻链和/或λ轻链。16.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，基因敲除的方法包括以下的一种或几种：基因打靶技术、CRISPR/Cas9方法、锌指核酸酶方法、转录激活子样效应因子核酸酶方法。17.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，基因敲除的步骤中，敲除小鼠编码IgM重链恒定区的基因的第1号外显子至编码IgG2c重链恒定区的基因的第1号外显子的全部核苷酸序列。18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，基因敲除的步骤中，使用了靶向小鼠编码IgM重链恒定区的基因的第1号外显子上游的sgRNA和靶向小鼠编码IgG2c重链恒定区的基因的第1号外显子下游的sgRNA；可选地，sgRNA靶向的小鼠编码IgM重链恒定区的基因的第1号外显子上游的靶向序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；和/或，sgRNA靶向的小...

【专利技术属性】
技术研发人员：王皓毅，叶建华，高晖，杜小明，仵毅，周鹏，项光海，王天姿，
申请(专利权)人：北京仁源欣生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：