一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用；所述的增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的有益效果是：本发明专利技术的所提供的增强子，可以在低温诱导的情况下特异启动增强目标基因的表达，同时在不寒冷的时候不会启动这个基因，不消耗植物多余的能量。采用增强子调控基因表达的模式能够避免组成型启动子非特异性启动基因表达，产生大量蛋白质或代谢产物对植物生长状况的影响。物生长状况的影响。物生长状况的影响。

【技术实现步骤摘要】
一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，特别是一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用。
[0002]
技术介绍

[0003]在农业生产中，寒冷对于植物的生长繁殖有较大影响。利用基因工程将外源抗寒基因导入植物细胞或植物体来提高植物的抗寒能力是一种有效手段。目前植物基因工程中基本是运用组成型启动子来驱动目的基因的表达，但组成型启动子在所有组织中都启动基因表达，不表现时空特异性及条件诱导性，在非胁迫环境下同样会产生大量蛋白质或代谢产物在植物体内积累，造成植物能量不必要的消耗，可能会打破了植物原有的代谢平衡，因而阻碍了植物的正常生长，导致作物减产，甚至导致死亡。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种低温诱导型增强子，为在基因工程中低温诱导特异表达关键基因提供功能元件。
[0005]本专利技术的提供一种低温诱导型增强子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]本专利技术提供的植物低温诱导型的增强子，能够用更为有效的调控元件代替组成型启动子增强目的基因的表达。在生产中，可以进行更加精准的分子育种，例如提高植物的抗寒性等，使植物遇到寒冷时的特异性提高相应蛋白表达显著提高，能够应对胁迫环境；再比如利用低温特异诱导一些物质的积累等等。利用低温诱导型增强子代替常规基因工程中的组成型顺式调控元件，可以使植物再其他条件下不表达外源基因，不消耗植物多余的能量。
[0007]本专利技术采用如下方法得到所述增强子：通过分析拟南芥的常温与冷处理的叶片RNA
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seq数据，发现FMO GS
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OX4 （AT1G62570）冷处理后基因表达上调150倍，对此基因的开放染色质进行分析，发现在此基因内含子区域存在一个低温诱导的开放染色质区域；具体步骤包括有：RNA
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seq数据的获得：对拟南芥叶片进行冷诱导，所述的冷诱导为在4℃下处理24小时，分别提取拟南芥常温和冷诱导叶片的mRNA，经过二代测序获得RNA
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seq数据，通过生信方法分析发现经过冷处理之后的拟南芥的FMO GS
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OX4 （AT1G62570）基因表达上调。
[0008]取样：同一生长期的常温下的拟南芥叶片和4℃处理24小时的拟南芥叶片；由北京诺禾致源科技股份有限公司进行mRNA的提取、建库以及二代测序；通过生信方法处理数据对比冷处理前后基因表达情况的变化；利用实验室已有的常温和冷诱导的拟南芥叶片的 DNase
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seq 数据，Nase
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seq 数据为两个生物学重复，进行全基因组DNaseI超敏感位点（DNase I Hypersensitive Sites）的鉴定，发现在基因内部第二个内含子的位置（chr1:23169889:23170650）有一个位点，在
常温下不开放在冷诱导下开放。
[0009]进一步的，本专利技术提供一种含有所述增强子的载体。
[0010]进一步的，本专利技术提供一种含有所述增强子的重组质粒。
[0011]进一步的，本专利技术提供一种所述增强子在植物低温诱导下增加基因表达中的应用。
[0012]进一步的，本专利技术提供一种特异性提高低温下目标基因表达的方法，包括利用基因工程手段，在植物中利用1所述的增强子实现基因的低温诱导表达，所述表达的方式包括以下方式中的一种或多种组合：（1）通过在植物中导入所述的增强子；（2）通过在植物中导入所述的载体；（3）通过在植物中导入所述的重组质粒。
[0013]进一步的，将所述的增强子和载体连接后，转化大肠杆菌，筛选获得构建成功载体的大肠杆菌，并提取大肠杆菌的质粒，转化农杆菌，将农杆菌打入烟草叶片组织中。
[0014]进一步的，将所述的增强子和载体连接后，转化大肠杆菌，筛选获得构建成功载体的大肠杆菌，并提取大肠杆菌的质粒，转化农杆菌，进行农杆菌介导的拟南芥遗传转化，筛选转基因纯合植物。
[0015]进一步的，本专利技术提供一种利用所述低温诱导增强子，特异提高植物低温下目标基因的表达的，及其在植物育种中的应用。
[0016]本专利技术具有以下优点：本专利技术的所提供的增强子，可以在低温诱导的情况下特异启动一些目的基因，如特异性提高低温下的某些有效成分的积累，或提高耐寒性，同时在不寒冷的时候不会启动这些目的基因，不消耗植物多余的能量。采用诱导型增强子调控基因表达的模式能够避免组成型启动子非特异性启动基因表达，产生大量蛋白质或代谢产物对植物生长状况的影响。
附图说明
[0017]图1 为常温与冷诱导条件下的11个基因表达量的比较结果。
[0018]图中RT为常温；Clod为冷诱导。
[0019]图2 为常温和冷诱导的拟南芥叶片的 DNase
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seq 数据，FMO GS
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OX4基因区在常温与寒冷情况下染色质开放程度视化图。
[0020]图3为烟草瞬时转化载体的示意图；图中，miniPro::LUC 为阴性对照；35sEn
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miniPro::LUC为阳性对照；Non
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DHS::miniPro::LUC为非DHS对照；C1R
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miniPro::LUC为阳性对照；DHS::miniPro::LUC为增强子验证载体；LUC为空载对照。
[0021]图4为常温下包括有增强子的烟草瞬时转化结果图；图中：1为mini增强子阴性对照；2为35s增强子正向阳性对照；3及5为非DHS对照4为C1R增强子反向阳性对照；6、7、8为增强子验证载体；9为空载体对照。
[0022]图5为拟南芥稳定转化载体的示意图；图中，miniPro::GUS为阴性对照；35sEn
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miniPro::GUS为阳性对照；DHS::
miniPro::GUS为增强子验证载体。
[0023]图6 为低温梯度时间诱导植株后GUS蛋白含量及染色情况图；图中，A为mini载体；B为35S载体；C为目标序列载体。
具体实施方式
[0024]为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施方式中的附图，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本专利技术实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
[0025]因此，以下对在附图中提供的本专利技术的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本专利技术的范围，而是仅仅表示本专利技术的选定实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低温诱导型增强子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种含有权利要求1所述增强子的载体。3.一种含有权利要求1所述增强子的重组质粒。4.权利要求1所述增强子在植物低温诱导下增加基因表达中的应用。5.一种特异性提高低温下目标基因表达的方法，其特征在于：包括利用基因工程手段，在植物中利用1所述的增强子实现基因的低温诱导表达，所述表达的方式包括以下方式中的一种或多种组合：（1）通过在植物中导入权利要求1所述的增强子；（2）通过在植物中导入权利要求3所述的载体；（3）通过在植物中导入含有权利要求4所述的重组质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱博，雷佳燕，吕若晗，牟心灵，童英杰，
申请(专利权)人：朱博，
类型：发明
国别省市：