一种基于点扫描策略的超分辨显微成像方法技术

本发明专利技术提供一种基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，包括：获取特定功率下扫描关闭显微镜的理想点扩散函数；扫描关闭显微镜的结构与共聚焦显微镜相同且其激光功率大于共聚焦显微镜；激光功率为使得点扩散函数为共聚焦光斑的小半部分时的激光功率；利用荧光探针对待测样品进行标记；利用激光功率在共聚焦显微镜上获取待测样品的原始测量图像；对原始测量图像进行处理，得到最终的超分辨图像。本发明专利技术的图像获取是在现有的共聚焦显微镜进行的，显微镜硬件方面无任何改进，仅仅需要对用于激发的激光功率进行提高以获得荧光关闭效应，获取一个方向的高分辨图像，然后变换扫描方向，获取多个方向的超分辨信息，最后通过配套的软件重建超分辨图像。重建超分辨图像。重建超分辨图像。

【技术实现步骤摘要】
一种基于点扫描策略的超分辨显微成像方法

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[0001]本专利技术属于光学显微镜领域，尤其涉及一种基于点扫描策略的超分辨显微成像方法。

技术介绍

[0002]经过二十多年的发展，超分辨显微镜已经成为生物学和化学研究的核心仪器设备。为获得衍射极限以下样品的空间结构信息，目前，市场上主流的超分辨仪器可分为三大类，分别是结构光照明显微术(SIM)，受激辐射损耗显微术(STED)和单分子定位显微术(PALM、STORM)。
[0003]结构光照明显微镜的主要原理是使用条纹状的激发光照射样品，然后从获得的图像中解析出样品的超分辨细节。然而产生这种条纹状的激发光需要复杂的光路，既增加了成本又提高了技术复杂度，后续还需要特殊的软件重构获得超分辨图像，稍有不慎便产生假象，并且由于条纹状的激发光也同样受衍射极限的限制，SIM的最终分辨率也只有100nm。
[0004]受激辐射损耗显微镜的基本原理是使用环形的光束将共聚焦光斑周围的荧光关闭，从而获得比较高分辨的点扩散函数，最终获得超分辨图像。环形光束的产生需要特殊的光学器件(螺旋相位板或空间光调制器)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，其特征在于，包括：步骤S0：获取扫描关闭显微镜的理想点扩散函数，并得到所述理想点扩散函数所对应的激光功率；其中，所述扫描关闭显微镜的结构与共聚焦显微镜相同且其激光功率大于共聚焦显微镜；所述理想点扩散函数所对应的激光功率为使得共聚焦显微镜的所成图像为共聚焦光斑的小半部分时的激光功率；步骤S1：利用荧光探针对待测样品进行标记；步骤S2：利用所述理想点扩散函数所对应的激光功率在共聚焦显微镜上获取待测样品的原始测量图像；步骤S3：对所述步骤S2获取的待测样品的原始测量图像进行处理，以得到待测样品的最终的超分辨图像。2.根据权利要求1所述的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤S0包括：将标准样品放置在共聚焦显微镜上，按照共聚焦显微镜的操作说明书调整共聚焦显微镜的扫描速度、扫描步长、针孔大小、接收带宽、探测器增益的测量参数，以观察所成图像；同时，从共聚焦显微镜的荧光聚焦透镜所在的成像端看到所成图像中的共聚焦光斑比较圆时所对应的共聚焦显微镜的激光功率开始，等间隔不断递增地调节共聚焦显微镜的激光功率并再次观察所成图像，直到所成图像中的光斑变为原本的共聚焦光斑的小半部分，此时得到的激光功率是扫描关闭显微镜的理想点扩散函数所对应的激光功率，用于将共聚焦显微镜调整为扫描关闭显微镜，并且此时的所成图像为扫描关闭显微镜的理想点扩散函数。3.根据权利要求2所述的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述标准样品为直径小于50nm的荧光微球。4.根据权利要求1所述的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述待测样品为生物样品；待测样品的荧光探针是荧光染料分子，利用荧光探针对待测样品进行标记是指对待测样品进行免疫荧光染色；且在所述步骤S2中，待测样品的原始测量图像是指待测样品在一个维度上的超分辨图像。5.根据权利要求1所述的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述待测样品为生物样品；待测样品的荧光探针是具有开关效应的荧光蛋白，利用荧光探针对待测样品进行标记是指对待测样品进行开关蛋白转染；且在所述步骤S2中，待测样品的原始测量图像是指待测样品在一个维度或者两个维度上的超分辨图像。6.根据权利要求1所述的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述步骤S2包括：将待测样品放置在共聚焦显微镜上，按照共聚焦显微镜的操作说明书调整共聚焦显微镜的扫描速度、扫描步长、针孔大小、接收带宽、探测器增益的测量参数，而激光功率则调整至步骤S1中的理想点扩散函数所对应的激光功率，以将共聚焦显微镜用作扫描关闭显微镜；随后，在待测样品处于荧光态的情况下利用扫描关闭显微镜测量获取待测样品的原始测量图像。7.根据权利要求1所述的基于点扫描策略的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述扫描关闭显微镜工作在高速模式或者高分辨模式下；在高速模式下，线扫描速度调整至400Hz，扫描步长调整至12nm，针孔大小调整为3艾里斑，激光功率调整至236μW；在高分辨模式下，线扫描速度调整至10Hz或100Hz，扫描步长调整至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊春海，高兆帅，康斌，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：