一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种针对多种新型冠状病毒(SARS

【技术实现步骤摘要】
一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
[0001]分案申请
[0002]本申请是申请号为202110676901.2，申请日为2021年6月18日，专利技术名称为“一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用”的专利申请的分案申请。


[0003]本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用。

技术介绍

[0004]新型冠状病毒(SARS
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2)，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：S蛋白(spike protein，)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein)。此外，还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、C端结构域1(CTD1)和C端结构域2(CTD2)，其中RBD主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。
[0005]截至目前，全球获批上市的疫苗共有8款，分别是美国批准紧急使用授权(EUA)的BNT162b2和mRNA
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1273，英国批准紧急使用授权(EUA)的AZD1222，中国国药中生(北京公司和武汉公司)和北京科兴的3款新冠灭活疫苗、康希诺生物腺病毒载体疫苗以及智飞生物重组蛋白疫苗，以及俄罗斯批准上市的“卫星V”，另外还有数十种疫苗处于临床研究不同阶段。这些已上市的疫苗无论是来自哪种技术路线，都对疫情防控做出了不同程度的贡献，然而由于新冠病毒的进化，不断出现各种突变，使现有疫苗的保护效果受到不同程度的影响。
[0006]新冠病毒属于RNA病毒，较易发生突变，全球已经报道了30000多个新冠病毒突变株，主要突变株包括：Alpha(B.1.1.7)突变株、Beta(B.1.351)突变株、Gamma(P1)突变株、Epsilon(B.1.429)突变株、Delta(B.1.617.2)，Kappa(B.1.617.1)突变株。这些突变株的突变位点主要存在于S蛋白的氨基酸序列，尤其是RBD区。因此，突变可能会提高病毒与ACE2受体的亲和力、减弱中和抗体效应，从而增强病毒毒力和传染力，加速病毒逃逸，降低疫苗保
护效果。因此，开发一种针对多种新冠病毒流行株的广谱性疫苗已成为当务之急。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有技术中缺少广谱新型冠状病毒疫苗(SARS
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2)的技术缺陷，提供了一种能够对多种新型冠状病毒流行株，同时产生良好交叉中和活性的单组分广谱重组RBD三聚体蛋白疫苗。
[0008]本专利技术提供的技术方案为：
[0009]一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白，所述三聚体蛋白是由三个新型冠状病毒RBD区域的亚基组成，所述三个新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列相同或至少一个不同；
[0010]当所述三个新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列相同时，所述氨基酸序列为如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或与其具有95％以上同源性的序列。
[0011]本专利技术基于新冠病毒S蛋白RBD区结构学特征，利用计算生物学方法设计了一种全新的融合蛋白，该蛋白包含有三个RBD结构域，在可以不引入任何外源连接臂或其它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式，实现RBD蛋白三聚化。利用基因工程技术重组表达并纯化RBD三聚体蛋白后，与佐剂混合制备成疫苗。按一定剂量和剂次免疫后，可产生针对多种新型冠状病毒流行株的保护性中和抗体，用于治疗和/或预防SARS
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2感染和/或新型冠状病毒疾病(COVID
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19)。由于RBD区功能明确，结构清楚，负责识别宿主细胞的ACE2受体，同时针对RBD产生的抗体功能明确，靶点特异，最大程度避免诱导机体产生抗体依赖的增强作用(Antibody Dependent Enhancement，ADE)。
[0012]本专利技术中所述的三聚体蛋白是由三个新型冠状病毒RBD区域的氨基酸片段按照N末端至C末端的顺序连接。
[0013]在本专利技术中，上述三聚体蛋白的三个RBD区域亚基的肽链长度可以为该新型冠状病毒S蛋白RBD区域的全长。作为优选，在本专利技术的实施方式中，上述新型冠状病毒RBD区域的肽链长度至少为该RBD区域序列全长的50％～99％。
[0014]上述该RBD区域全长的50％～99％可以为该RBD区域全长的50％、60％、70％、80％、90％或99％，其中至少包含一个或多个各不相同的氨基酸残基。
[0015]更优选地，在本专利技术的一个实施方式中，上述新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列为S蛋白的第319～537位氨基酸。
[0016]在本专利技术中，上述新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列可以来自不同的新型冠状病毒流行株的S蛋白的RBD结构域，例如，原型株新冠病毒，同时携带有L452R和E484Q突变的Kappa(B.1.617)新冠病毒、携带有D614G突变的新冠病毒、携带有L452R突变的新冠病毒、携带有N501Y、P681H、69
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70del等多个突变的Alpha(B.1.1.7)新冠病毒、携带有N501Y、K417N、E484K等突变的Beta(B.1.135)新冠病毒、携带有N501Y、E484K和K417T突变的Gamma(P.1)新冠病毒等。上述序列可以通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的数据库获得。
[0017]作为优选，在本专利技术的实施方式中，上述新型冠状病毒RBD区域的氨基酸序列为如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或与其具有95％以上同本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白，其特征在于，所述三聚体蛋白是由三个新型冠状病毒RBD区域的亚基组成，所述三聚体蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列包含如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含选自信号肽、标签或免疫增强肽中的一种或几种。4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白，或编码如权利要求2或3所述的融合蛋白的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。6.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求4所述的核酸分子。7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求6所述的载体。8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为CHO细胞。10.如权利要求1所述的重组新型冠状病毒RBD三聚体蛋白或如权利要求2或3所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A)制备如权利要求4所述的核酸分子，构建该核...

【专利技术属性】
技术研发人员：李启明，梁宇，张靖，苏计国，韩子泊，邵帅，侯亚楠，张浩，陈实，靳玉琴，张学峰，杜丽芳，侯俊伟，马智静，雷泽华，郑凡，唐芳，刘兆明，刘宁，
申请(专利权)人：国药中生生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：