一株产制霉色基素的大别山五针松内生链霉菌及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一株产制霉色基素的大别山五针松内生链霉菌及其发酵工艺。本发明专利技术从濒危植物大别山五针松植物中分离到一株内生放线菌WP

【技术实现步骤摘要】
一株产制霉色基素的大别山五针松内生链霉菌及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一株产制霉色基素的大别山五针松内生链霉菌及其制备方法。

技术介绍

[0002]农作物在种植过程中经常会受到来自于细菌、真菌和病毒感染的威胁，尤其以真菌性病害最为常见，造成作物生长过程中坏死、腐烂、枯萎、变色、畸形等，严重影响农作物的产量和质量。目前用于防治作物真菌性病害的主要方法是化学药剂防治法，如代森锰锌、霜脲氰锰锌、波尔多、百菌清、甲基硫菌灵、多菌灵、福美双、甲霜灵、戊唑醇、乙磷铝等，但类似上述化学药剂防治法往往造成农作物的化学残留、环境和食品安全的隐患等。长期使用化学药剂防治也会加快农作物致病菌的抗药性，如此造成恶性循环，不符合绿色农业和可持续发展的现代理念。
[0003]近年来，国内外逐步使用生物防治法控制农作物各种病害，其中主要包括利用有益微生物或微生物的发酵代谢产物来防治农作物各种病害，这些有益微生物通常包括细菌、放线菌、酵母菌甚至霉菌。实际应用中，往往利用有益微生物的活菌体或菌体的代谢产物制成粉剂、颗粒剂、液剂、悬浮剂或含菌肥料等，防治农作物真菌性病害，并取得了明显的防治效果和环境改善效应。其主要原理在于：有益微生物制剂通过喷洒或浇灌在自然条件下可以大量的繁殖，从而与植物病原菌形成占位及营养竞争，甚至分泌代谢产物，直接杀死植物病原菌或诱导植物对病原菌产生抗性；有些有益微生物还可产生植物生长刺激素、维生素等活性物质促进植株生长，增加作物产量。这些微生物源产品的优点是对人、动物和有益昆虫毒性低、室外环境降解快、残留小、有利于绿色农业和可持续发展。当前该领域用于防治农作物真菌性病害的产品主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、木霉菌等微生物活菌体制剂；微生物的代谢产物制剂也普遍推广使用，如用井冈霉素水剂(或可湿性粉剂)防治水稻纹枯病、春雷霉素水剂(或可湿性粉剂)防治水稻稻瘟病、多抗霉素水剂(或可湿性粉剂)防治小麦根腐病、武夷霉素水剂(或可湿性粉剂)防治黄瓜白粉病、中生菌素水剂(或可湿性粉剂)防治苹果腐烂病等。由于农作物品种繁多，病害复杂，可用于生物防治的品种数量还十分有限，另外也存在有些品种药效缓慢或药效不明显等缺陷。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种新的高效防治农作物真菌性病害的链霉菌。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供一种优化的发酵工艺，提高上述链霉菌代谢产物的产量，以实现工业化生产。
[0006]本专利技术提供了一株链霉菌，结晶紫染色后在光学显微镜下观察插片上菌株的基内菌丝、气生菌丝、孢子及孢子丝的形态。如图2所示，放线菌的菌落早期绒状，后期菌落呈粉状、干燥，有淡黄色色素沉积呈同心圆放射状；菌落表面为浅灰白色，并伴有较浓土腥味道；
基内菌丝无横隔，分枝多；气生菌丝呈现直或者弯曲，有横隔，呈现明显的结节状。
[0007]所述链霉菌的16S rDNA含有如SEQ ID NO 1所示的序列。
[0008]本专利技术提供了一种新的高效防治农作物真菌性病害的链霉菌，该链霉菌是从中国特有的濒危植物大别山五针松树皮中分离得到，已于2020年1月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号：CGMCC NO.19354。结合菌株生长的形态特征和16S rDNA序列分析，该菌属于链霉菌(Streptomyces sp)，该菌株命名为 Streptomyces sp WP-1。
[0009]本专利技术提供了所述的链霉菌的制备方法，包括：
[0010]清洁并且消毒大别山五针松的树皮，切成小块接种到PDA培养基上；
[0011]培养一周后，将培养基上长出的单菌落挑出，分别接种到PDA培养基上，培养一周后，取直径不小于6mm的菌饼备用；
[0012]以植物病原菌尖孢镰刀菌为靶标菌，使用平板对峙培养法进行生防菌株的筛选。
[0013]所述的PDA培养基可以通过市售渠道获得。
[0014]另一方面，本专利技术提供了一种优化的发酵工艺，提高上述链霉菌代谢产物的产量，以实现工业化生产。经前期研究该菌株的基本发酵工艺为：葡萄糖2％，麦芽糖2％，棉籽粉 5％，并含有少量无机盐硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、硫酸镁等，初始pH6.5，装液量为50ml/250ml 三角瓶，接种量8％，培养温度28℃，转速180r/min，培养6天，摇瓶发酵水平可达 1.3675g/L。本专利技术优化了前期的基本发酵工艺，通过碳源调控、添加捕氨剂及无机磷酸盐和氧载体等，摇瓶发酵水平达5.5g/L以上，生产成本可大幅降低，具备工业化大规模生产的能力。本专利技术提供的链霉菌发酵代谢产物为一种多烯大环内酯类物质，经鉴定该物质为制霉色基素(Fungichromin,FC)，对大多数致病真菌有杀灭作用，可广泛的用于防治农作物真菌性病害，如致病疫霉(Phytophthora infestan)引起的马铃薯晚疫、立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的西瓜枯萎病等，并且该物质对光敏感，光照条件下容易分解，不易造成环境污染和在农作物中的残留等。中国台湾专利TWI338048B描述了制霉色基素的制备方法，是由链霉菌(Streptomycespadanus PMS-702)在脱脂黄豆粉、葡萄糖、碳酸钙和微量二价盐离子为基质的培养基中23.8℃发酵培养6天，发酵过程中补加一定量的玉米油，制霉色基素最高产量可达约2.05 g/L，其发酵水平远不及本专利技术。
[0015]本专利技术提供了所述的链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：
[0016](1)链霉菌WP-1的活化；
[0017](2)链霉菌WP-1的液体发酵，包括种子液的制备和链霉菌的发酵。
[0018]较好的，所述的发酵方法中使用优化后的无菌固体培养基培养链霉素WP-1；
[0019]其中，优化后的无菌固体培养基组成为每100ml中含有：葡萄糖0.3-2.0g，酵母膏 0.3-1.0g，蛋白胨0.3-1.0g，牛肉膏0.08-0.30g，硫酸镁0.02-0.30g，磷酸氢二钾 0-0.40g。
[0020]本专利技术中，链霉菌WP-1产制霉色基素的发酵条件优化包括：
[0021]链霉菌WP-1液态发酵产生制霉色基素的基本工艺条件：
[0022]培养基：葡萄糖2％，麦芽糖2％，棉籽粉5％，硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、硫酸镁等；初始pH6.5，装液量50ml培养基/250ml三角瓶；发酵工艺：接种量8％，培养温度28℃，转速180r/min，连续培养6天，摇瓶发酵水平可达1.3675g/L。
[0023]在本专利技术的一个优选实施例中，制霉色基素(FC)的HPLC检测条件：
[0024]使用C18反相柱(Waters X-Bridge 5μm 4.6
×
250mm)进行HPLC对发酵液中制霉色基素的含量测定。流动相为HPLC级甲醇：水＝60：40(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株链霉菌，其特征在于，所述的链霉菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC NO.19354；所述链霉菌的16S rDNA含有如下序列：TCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCGTCTTGGGCATCCTTGACGGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：李继扬，彭城，安多朋，朱袁兴，丁文鑫，瞿涤，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：