一种β-防御素2抗菌肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
防御素2抗菌肽的制备方法


[0001]本专利技术涉及多肽合成
，尤其涉及一种β
‑
防御素2抗菌肽的制备方 法。

技术介绍

[0002]人类在1980年发现了抗菌肽后，这类具有抗菌活性的多肽物质始终备受关 注，由于抗菌肽对细菌有着很强的杀伤效果，并且不容易产生抗药性，潜力巨大。 于是人们陆续从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物、人类中发现 并分离获得各种抗菌肽，其中防御素就广泛分布在真菌、植物与动物中，β
‑
防 御素2抗菌肽就是其中的一种。
[0003]β
‑
防御素2抗菌肽是1991年在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的，是由41 个氨基酸组成的多肽，并且包含三对二硫键，其序列为：
[0004]H
‑
Gly
‑
Ile
‑
Gly
‑
Asp
‑
Pro
‑
Val
‑
Thr
‑
Cys
‑
Leu
‑
Lys
‑
Ser
‑
Gly
‑
Ala
‑
Ile
‑
Cys
‑
His
‑
Pro
ꢀ‑
Val
‑
Phe
‑
Cys
‑
Pro
‑
Arg
‑
Arg
‑
Tyr
‑
Lys
‑
Gln
‑
Ile
‑
Gly
‑
Thr
‑
Cys
‑
Gly
‑
Leu
‑
Pro
‑
Gly
‑ꢀ
Thr
‑
Lys
‑
Cys
‑
Cys
‑
Lys
‑
Lys
‑
Pro
‑
OH，分子式为：C188H305N55O55S6，分子量为： 4328.23，其中Cys8与Cys37、Cys15与Cys30、Cys20与Cys38组成了三对二硫 键，因此β
‑
防御素2抗菌肽具备较长的半衰期。
[0005]但同时由于结构式中具备三对二硫键，不可避免地增加了生产的难度，特别 是进行二硫键成环的操作中，氧化产生的杂质或者合成产生的杂质会产生不小的 影响，因此本专利技术是基于克服上述β
‑
防御素2抗菌肽生产难度大、副反应多而 设计的一种新工艺。

技术实现思路

[0006]为了解决上述
技术介绍
中所提到的技术问题，而提出的一种β
‑
防御素2抗 菌肽的制备方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0008]一种β
‑
防御素2抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1、选择Fmoc
‑
Pro
‑2‑
Chlorotrityl Chloride Resin树脂，溶胀后脱除Fmoc 保护基；
[0010]S2、按照β
‑
防御素2抗菌肽的序列，依次从C端到N端进行偶联直至最后 一个氨基酸Fmoc
‑
Gly
‑
OH，脱除Fmoc保护基后得到β
‑
防御素2抗菌肽树脂肽， 其中，N端第8、15、30、37位使用的氨基酸为Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH，第20、38 位使用的氨基酸为Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
OH，N端第1、2、3位使用的反应原料为 Fmoc
‑
Gly
‑
Ile
‑
Gly
‑
OH，N端第27、28位使用的反应原料为Fmoc
‑
Ile
‑
Gly
‑
OH； Asp、Thr、Lys、Ser、His、Arg、Tyr、Gln的侧链保护基分别是OtBu、tBu、Boc、 tBu、Trt、Pbf、tBu、Trt，所有氨基酸α位氨基的保护基均为Fmoc；
[0011]S3、用TFA/DCM溶液与β
‑
防御素2抗菌肽树脂反应，过滤得到带有侧链保 护基的β
‑
防御素2抗菌肽，其中第20、38位的Cys侧链巯基裸露；
[0012]S4、将带有侧链保护基的β
‑
防御素2抗菌肽与TFA/DCM的混合溶液调节PH 值至中性，旋蒸浓缩后，将其溶解到DMF中调节PH值至7.5
‑
8.0，加入H2O2进行 氧化反应，反应结束
后加水析出后过滤，得到含一对二硫键的β
‑
防御素2抗菌肽；
[0013]S5、通过裂解液与上述含一对二硫键的β
‑
防御素2抗菌肽反应，得到脱除所有侧链保护基且含一对二硫键的β
‑
防御素2抗菌肽；
[0014]S6、将含一对二硫键的β
‑
防御素2抗菌肽溶解在纯水中，在磷酸缓冲液条件下，持续搅拌反应，最终得到粗品目的产物β
‑
防御素2抗菌肽；
[0015]S7、使用半制备色谱纯化分离,冻干后即得到β
‑
防御素2抗菌肽成品。
[0016]进行偶联时，使用的偶联体系为：HOBT、HOAT、Cl
‑
HOBT中的任意一个或一个以上与DIC或DIEA与HOBT、HOAT、Cl
‑
HOBT中的任意一个或一个以上与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成偶联体系，偶联体系、偶联组合和缩合剂之间可以互通。
[0017]在本专利技术的制备工艺步骤S1中，使用的树脂Fmoc
‑
Pro
‑2‑
ChlorotritylChlorideResin替代度为0.25
‑
0.55mmol/g的，选择合理的替代度，能提高生产效率，降低杂质的产生，通过平行对照实验选出替代度为0.35
‑
0.45mmol/g时为优；
[0018]在本专利技术的制备工艺步骤S2中，使用的Cys侧链保护基选择中，有如下选择方式：N端第15、20、30、38位使用的氨基酸为Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH，第8、37位使用的氨基酸为Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
OH；N端第8、20、37、38位使用的氨基酸为Fmoc
‑
Cys(T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
‑
防御素2抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、选择Fmoc
‑
Pro
‑2‑
Chlorotrityl Chloride Resin树脂，溶胀后脱除Fmoc保护基；S2、按照β
‑
防御素2抗菌肽的序列，依次从C端到N端进行偶联直至最后一个氨基酸Fmoc
‑
Gly
‑
OH，脱除Fmoc保护基后得到β
‑
防御素2抗菌肽树脂肽，其中，N端第8、15、30、37位使用的氨基酸为Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH，第20、38位使用的氨基酸为Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
OH，N端第1、2、3位使用的反应原料为Fmoc
‑
Gly
‑
Ile
‑
Gly
‑
OH，N端第27、28位使用的反应原料为Fmoc
‑
Ile
‑
Gly
‑
OH；Asp、Thr、Lys、Ser、His、Arg、Tyr、Gln的侧链保护基分别是OtBu、tBu、Boc、tBu、Trt、Pbf、tBu、Trt，所有氨基酸α位氨基的保护基均为Fmoc；S3、用TFA/DCM溶液与β
‑
防御素2抗菌肽树脂反应，过滤得到带有侧链保护基的β
‑
防御素2抗菌肽，其中第20、38位的Cys侧链巯基裸露；S4、将带有侧链保护基的β
‑
防御素2抗菌肽与TFA/DCM的混合溶液调节PH值至中性，旋蒸浓缩后，将其溶解到DMF中调节PH值至7.5
‑
8.0，加入H2O2进行氧化反应，反应结束后加水析出后过滤，得到含一对二硫键的β
‑
防御素2抗菌肽；S5、通过裂解液与上述含一对二硫键的β
‑
防御素2抗菌肽反应，得到脱除所有侧链保护基且含一对二硫键的β
‑
防御素2抗菌肽；S6、将含一对二硫键的β
‑
防御素2抗菌肽溶解在纯水中，在磷酸缓冲液条件下，持续搅拌反应，最终得到粗品目的产物β
‑
防御素2抗菌肽；S7、使用半制备色谱纯化分离,冻干后即得到β
‑
防御素2抗菌肽成品。2.根据权利要求1所述的一种β
‑
防御素2抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述偶联体系为：HOBT、HOAT、Cl
‑
HOBT中的任意一个或一个以上与DIC或DIEA与HOBT、HOAT、Cl
‑
HOBT中的任意一个或一个以上与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成偶联体系。3.根据权利要求2所述的一种β
‑
防御素2抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述Fmoc
‑
Pro
‑2‑
Chlorotrityl Chloride Resin树脂替代度为0.25
‑
0.55mmol/g。4.根据权利要求3所述的一种β
‑
防御素2抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述Cys侧链保护基选择中，包含以下选择方式：N端第15、20、30、38位使用的氨基酸为Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH，第8、37位使用的氨基酸为Fmoc
‑
Cy...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈永刚，肖攀，谢振亮，付坤，沈永良，程益明，胡桂香，
申请(专利权)人：杭州固拓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：