用于对多核苷酸进行测序的方法技术

本发明专利技术涉及对高通量核酸测序方法的改进，并且特别是涉及对在成对测序期间进行延伸反应的方法的改进。本发明专利技术涉及一种在成对测序期间进行链再合成延伸反应的方法，其中所述链再合成延伸反应在第一测序读取与第二测序读取之间进行，并且其中所述链再合成延伸反应延伸一种或多种固定化引物以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；其特征在于，所述链再合成延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处、优选地在38℃处进行。优选地在38℃处进行。优选地在38℃处进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于对多核苷酸进行测序的方法


[0001]本专利技术涉及对高通量核酸测序方法的改进，并且特别是涉及对在成对测序期间进行延伸反应的方法的改进。

技术介绍

[0002]核酸测序方法已在本领域中已知多年。一些此类方法基于荧光标记的核酸类似物的连续掺入循环。在此类“边合成边测序”或“循环测序”方法中，在每次核苷酸添加后通过检测荧光标记来确定所添加的碱基的身份。
[0003]特别地，US 5,302,509描述了一种用于对多核苷酸模板进行测序的方法，该方法涉及使用DNA聚合酶或DNA连接酶执行多个延伸反应，以连续地掺入与模板链互补的标记多核苷酸。在此类“边合成边测序”反应中，通过连续掺入与模板链互补的单个核苷酸，在5'至3'方向上构建与模板链碱基配对的新多核苷酸链。在测序反应中使用的底物三磷酸核苷在3'位置处用不同的3'标记进行标记，从而允许在添加连续核苷酸时确定所掺入的核苷酸的身份。
[0004]为了进行准确测序，可将可逆链终止结构修饰或“封闭基团”添加到底物核苷酸中，以确保核苷酸以受控方式一次一个地掺入。当掺入每个单核苷酸时，封闭基团本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在成对测序期间进行链再合成延伸反应的方法，其中所述链再合成延伸反应在第一测序读取与第二测序读取之间进行，并且其中所述链再合成延伸反应延伸一种或多种固定化引物以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；其特征在于，所述链再合成延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非热稳定聚合酶具有低于55℃、优选地低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于39℃、等于或低于38℃、约38℃或约37℃、特别优选地约38℃的最佳温育温度和/或最佳活性温度。3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述延伸反应在小于55℃、优选地小于50℃、优选地小于40℃、优选地38℃+/
‑
2℃、优选地38℃+/
‑
1℃、优选地38℃的温度处进行。4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述非热稳定聚合酶是Bsu、phi29、Klenow和DNA聚合酶I(大肠杆菌)，优选地是Bsu或其功能片段。5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述链再合成延伸反应通过多个延伸和变性的循环重复。6.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个循环；优选地2至5个循环、2至4个循环、3至5个循环、3个循环或4个循环；最优选地3个循环。7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中每个循环可持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或30分钟。8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，所述方法包括以下延伸和变性的循环：3
×
5min；3
×
30min；12
×
2min；6
×
4min；2
×
12min或3
×
5min；优选地12
×
2min。9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中变性基本上在所述延伸反应的所述温度处...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：因美纳有限公司，
类型：发明
国别省市：