用于对多核苷酸进行测序的方法技术

本发明专利技术涉及对高通量核酸测序方法的改进，并且特别是涉及对在成对测序期间进行延伸反应的方法的改进。本发明专利技术涉及一种在成对测序期间进行链再合成延伸反应的方法，其中所述链再合成延伸反应在第一测序读取与第二测序读取之间进行，并且其中所述链再合成延伸反应延伸一种或多种固定化引物以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；其特征在于，所述链再合成延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处、优选地在38℃处进行。优选地在38℃处进行。优选地在38℃处进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于对多核苷酸进行测序的方法


[0001]本专利技术涉及对高通量核酸测序方法的改进，并且特别是涉及对在成对测序期间进行延伸反应的方法的改进。

技术介绍

[0002]核酸测序方法已在本领域中已知多年。一些此类方法基于荧光标记的核酸类似物的连续掺入循环。在此类“边合成边测序”或“循环测序”方法中，在每次核苷酸添加后通过检测荧光标记来确定所添加的碱基的身份。
[0003]特别地，US 5,302,509描述了一种用于对多核苷酸模板进行测序的方法，该方法涉及使用DNA聚合酶或DNA连接酶执行多个延伸反应，以连续地掺入与模板链互补的标记多核苷酸。在此类“边合成边测序”反应中，通过连续掺入与模板链互补的单个核苷酸，在5'至3'方向上构建与模板链碱基配对的新多核苷酸链。在测序反应中使用的底物三磷酸核苷在3'位置处用不同的3'标记进行标记，从而允许在添加连续核苷酸时确定所掺入的核苷酸的身份。
[0004]为了进行准确测序，可将可逆链终止结构修饰或“封闭基团”添加到底物核苷酸中，以确保核苷酸以受控方式一次一个地掺入。当掺入每个单核苷酸时，封闭基团防止任何另外的核苷酸掺入到多核苷酸链中。一旦已确定最后掺入的标记核苷酸的身份，就去除标记部分和封闭基团，从而允许下一个封闭的标记核苷酸在随后一轮测序中被掺入。
[0005]“配对末端”或“成对”测序(此类术语在本文中可互换使用)的技术通常是分子生物学领域已知的，特别是在全基因组鸟枪测序的背景中。配对末端测序允许确定来自单个多核苷酸双链体上两个位置的序列的两个“读取”。配对末端方法的优点是，与以随机方式对两个独立模板中的每个模板的“n”个碱基进行测序相比，对单个模板中各自具有“n”个碱基的两个片段进行测序获得的信息显著更多。通过使用适当的组装序列信息的软件工具，可能利用以下知识，即“配对末端”序列并非完全随机，而是已知发生在单个双链体上并且因此在基因组中连接或配对。这种信息已显示出极大地帮助将全基因组序列组装成一致的序列。
[0006]配对末端测序通常通过利用专门的环形鸟枪克隆载体来执行。在特定的单个位点处切割载体之后，将待测序的模板DNA(通常为基因组DNA)插入载体中并将末端再密封以形成新的构建体。侧接插入DNA的载体序列包含用于测序引物的结合位点，该测序引物允许对相反链上的插入DNA进行测序。然而，在模板片段的两端对测序引物的需要使得基于阵列的测序技术的使用极其困难。对于通常依赖于单链模板的基于阵列的技术，通常仅可从核苷酸模板的一端进行测序，因为互补链不附接到表面。
[0007]为了使核酸测序反应的通量最大化，能够对多个模板分子进行并行测序是有利的。可使用核酸阵列技术来实现多个模板的并行处理。这些阵列通常由固定在固体支持材料上的高密度多核苷酸矩阵组成，并且通常依赖于单链模板。
[0008]已报道了可在固体支持物上进行的多核苷酸模板的双末端测序的各种方法。例
如，核酸扩增方法是已知的，该方法允许将扩增产物固定在固体支持物上，以便形成由簇或“集落”组成的阵列，该簇或“集落”由多个相同的固定化多核苷酸链和多个相同的固定化互补链形成。根据这些方法制备的簇阵列上的DNA集落中存在的核酸分子可提供用于测序反应的模板。
[0009]在WO 2008/041002中，描述了一种成对测序方法，该方法包括：(a)提供固体支持物，该固体支持物在其上固定有多个双链模板多核苷酸，每个双链模板多核苷酸由在其5'端连接到固体支持物的互补的第一模板链和第二模板链形成，并且一个或多个5'
‑
端固定化引物的多个拷贝能够与第一模板链的3'端杂交；(b)处理该多个双链模板多核苷酸，使得第一模板链与5'
‑
端固定化引物杂交；(c)进行第一测序读取以确定该模板多核苷酸的第一区域的序列；(d)进行延伸反应以延伸固定化引物中的一者或多者以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；(e)处理该多个第一固定化模板链和第二固定化模板链，以从固体支持物去除第一模板链；以及(f)进行第二测序读取以确定该模板多核苷酸的第二区域的序列，其中确定靶标多核苷酸的第一区域和第二区域的序列实现所述靶标双链多核苷酸的所述第一区域和所述第二区域的成对测序。
[0010]仍然存在改进测序平台的持续需要，包括增加运行速度、提高效率、增加准确度和/或简化过程。

技术实现思路

[0011]根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于在成对测序期间进行链再合成延伸反应的方法，其中所述链再合成延伸反应在第一测序读取与第二测序读取之间进行，并且其中所述链再合成延伸反应延伸一种或多种固定化引物以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；其特征在于，所述链再合成延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处进行。
[0012]根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于在靶标多核苷酸的第一区域和第二区域的成对测序期间进行延伸反应的方法，其中所述第一区域和所述第二区域位于同一靶标多核苷酸中，所述成对测序包括以下步骤：
[0013](a)提供固体支持物，该固体支持物在其上固定有多个第一双链模板多核苷酸和第二双链模板多核苷酸，每个双链模板多核苷酸由第一模板链及其互补物或第二模板链及其互补物形成，其中第一模板链和第二模板链在5'端连接到固体支持物，并且其中连接到固体支持物的第一模板链或第二模板链还包含5'固定化延伸引物；
[0014](b)选择性地去除第一模板链互补物和第二模板链互补物，并选择性地去除第二模板链，以允许第一测序引物与第一模板链杂交；
[0015](c)通过边合成边测序技术或通过边连接边测序技术进行第一测序读取以确定该模板多核苷酸的第一区域的序列；
[0016](d)进行延伸反应以延伸固定化引物中的一者或多者以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；
[0017](e)选择性地去除第一模板链，以允许第二测序引物与步骤(d)中生成的第二模板链杂交；
[0018](f)通过边合成边测序技术或通过边连接边测序技术进行第二测序读取以确定该
模板多核苷酸的第二区域的序列，其中确定该靶标多核苷酸的第一区域和第二区域的序列实现所述靶标多核苷酸的所述第一区域和所述第二区域的成对测序；
[0019]其中步骤(d)延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处进行。
[0020]已令人惊讶地发现，在第一序列读取后进行的延伸反应可用非热稳定链置换聚合酶在较低的温度处进行，并且仍然保持高水平的链再合成。使用非热稳定链置换聚合酶也可导致另外的优点，包括：更快的再生时间；包括减少的处理步骤的简化方案；减少所使用的不同试剂的数量和/或所使用的试剂的量；降低化学的复杂性；和/或降低用于进行该方法的盒的复杂性。
[0021]根据另一方面，提供了一种用于对靶标多核苷酸的第一区域和第二区域进行成对测序的方法，其中所述第一区域和所述第二区域位于同一靶标多核苷酸中，所述成对测序包括如本文所述的延伸反应。
[0022]根据另一方面，提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在成对测序期间进行链再合成延伸反应的方法，其中所述链再合成延伸反应在第一测序读取与第二测序读取之间进行，并且其中所述链再合成延伸反应延伸一种或多种固定化引物以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；其特征在于，所述链再合成延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非热稳定聚合酶具有低于55℃、优选地低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于39℃、等于或低于38℃、约38℃或约37℃、特别优选地约38℃的最佳温育温度和/或最佳活性温度。3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述延伸反应在小于55℃、优选地小于50℃、优选地小于40℃、优选地38℃+/
‑
2℃、优选地38℃+/
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1℃、优选地38℃的温度处进行。4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述非热稳定聚合酶是Bsu、phi29、Klenow和DNA聚合酶I(大肠杆菌)，优选地是Bsu或其功能片段。5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述链再合成延伸反应通过多个延伸和变性的循环重复。6.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个循环；优选地2至5个循环、2至4个循环、3至5个循环、3个循环或4个循环；最优选地3个循环。7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中每个循环可持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或30分钟。8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，所述方法包括以下延伸和变性的循环：3
×
5min；3
×
30min；12
×
2min；6
×
4min；2
×
12min或3
×
5min；优选地12
×
2min。9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中变性基本上在所述延伸反应的所述温度处...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：因美纳有限公司，
类型：发明
国别省市：