一种肝衰竭检测试剂及其在肝衰竭检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种肝衰竭检测试剂及其制备方法，检测试剂由以下试剂混合而成，试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；试剂C：由8

【技术实现步骤摘要】
一种肝衰竭检测试剂及其在肝衰竭检测中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种肝衰竭的检测方法，具体涉及一种基于血清糖蛋白寡糖链检测(G
‑
Test)特异指纹图谱的肝衰竭检测方法。

技术介绍

[0002]肝功能衰竭(Liver Failure)，是指多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。一般可分为急性肝功能衰竭(Acute Liver Failure，ALF)和慢性肝功能衰竭(Chronic Liver Failure，CLF)。临床表现为极度乏力，并有明显厌食、腹胀、恶心、呕吐等严重消化道症状。肝脏作为人体的重要器官之一，因其具有合成、解毒、代谢、分泌、生物转化以及免疫防御等功能，故又被称为“加工厂”。当受到多种因素(如病毒、酒精、药物等)引起严重损害时，造成肝细胞大量坏死，导致上述功能发生严重障碍或失代偿，进而出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群，称之为肝衰竭。引起肝衰竭的主要病因是肝炎病毒(主要是乙型肝炎病毒,约占80
‑
85％)，非肝炎病毒、药物及有毒物质(异烟肼、四氯化碳、酒精等)、急性妊娠脂肪肝/HELLP综合征、自身免疫性肝炎和肿瘤细胞广泛浸润。
[0003]根据临床表现的严重程度，急性肝衰竭和慢性肝衰竭可分为早期、中期和晚期。临床诊断：肝衰竭的临床诊断需要依据病史、临床表现和辅助检查等综合分析而确定。下列指标常用于肝衰竭的临床诊断：总胆红素，白蛋白或前白蛋白明显下降，谷草转氨酶(AST)/谷丙转氨酶(ALT)比值>1，血清胆碱酯酶活力显著降低，凝血酶原活动度(PTA)<40％，支链氨基酸/芳香氨基酸比值(BCAA/AAA)显著下降，血氨水平明显升高，血内毒素水平升高，影像学检查提示肝脏体积进行性缩小，血胆固醇水平明显降低。但是这些指征只能作为诊断的部分依据，并需要组织病理学的辅助诊断。组织病理学检查在肝衰竭的诊断、分类及预后判定上具有重要价值，但由于肝衰竭患者的凝血功能严重降低，实施肝穿刺具有一定的风险。
[0004]蛋白质的糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。有些酶和激素是糖蛋白。糖蛋白具有多种生物功能。有些糖蛋白如原胶原是结构蛋白质。许多酶和激素(如黄体生成素、促甲状腺激素等)有糖蛋白结构，血液中的许多糖蛋白担负无机离子(Fe2+、Ca2+、Cu2+等)和激素等生物活性物质的运输，血液凝固(纤维蛋白原是糖蛋白)和抗体活性等生物功能。凝集素有凝集细胞的能力，糖链还可起稳定肽链的作用。糖蛋白的另一重要功能是直接或间接地参与细胞表面的种种识别现象。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前，己经在多种肿瘤中发现了N
‑
糖链的改变。
[0005]糖链是重要的生物信息分子，在许多生理和病理过程中都发挥着独特作用。糖链结构非常复杂，具有微观不均一性，其分析和结构解析一直是糖生物学研究的瓶颈。目前糖
链结构的分析方法发展迅速，主要包括(1)高效液相色谱法(HPLC)：分辨率高，检测速度快，重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；(2)质谱法(MS)：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，是糖链定性定量分析的一种理想手段。但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；(3)毛细管电泳法(CE)：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如HPLC。
[0006]G
‑
Test检测法(Glycan
‑
Test)是基于DNA分析仪的毛细管微电泳技术(DSA
‑
FACE)，将前列腺液样本中糖蛋白的N
‑
糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的N
‑
寡糖链的含量即指纹图谱(简称G
‑
Test图谱)。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(2μL血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96
‑
孔板)等其他糖链分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可望用于临床推广使用。
[0007]血清寡糖链G
‑
Test检测是一种无创，快速，简单，高灵敏度，高特异度的可靠方法，为肝衰竭患者的早期检测提供服务。

技术实现思路

[0008]本专利技术采用的技术方案如下：
[0009]一种肝衰竭检测试剂，由以下试剂组成：
[0010]试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
[0011]试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
[0012]试剂C：由8
‑
氨基芘
‑
1,3,6
‑
三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
[0013]试剂D：终止液。
[0014]优选地，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比为2：2：1。
[0015]一种肝衰竭检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0016]步骤一寡糖链的制备
[0017]在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
[0018]步骤二寡糖链的标记
[0019]在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
[0020]步骤三寡糖链分离分析
[0021]取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
[0022]优选地，所述步骤一寡糖的制备中变性温度为不低于75℃加热，孵育温度为不低于25℃。
[0023]优选地，所述步骤二中荧光标记的温度为50～90℃。
[0024]一种组合物在制备肝衰竭检测试剂中的应用，所述组合物通过(NGA2F+NG1A2F+NA2F)/NA2的比值来检测肝衰竭。
[0025]本专利技术提供一种肝衰竭的血清糖蛋白N
‑
糖组图谱模型的建立方法，通过测定血清
糖蛋白寡糖链G
‑
Test特异指纹图谱，进行统计学分析。
[0026]材料和方法：
[0027]一、检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝衰竭检测试剂，其特征在于，由以下试剂组成：试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；试剂C：由8
‑
氨基芘
‑
1,3,6
‑
三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；试剂D：终止液。2.根据权利要求1所述的肝衰竭检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比是2：2：1。3.根据权利要求1所述的肝衰竭检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一寡糖链的制备在经过灭活处理的2μL血清...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翠英，王蕾，谈宗男，徐蕾，
申请(专利权)人：江苏先思达生物科技有限公司陈翠英，
类型：发明
国别省市：