一种基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂及其制备方法和应用，检测试剂由以下试剂混合而成，试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP

【技术实现步骤摘要】
一种基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种乳腺癌的检测方法，具体涉及一种基于血清寡糖链G
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Test特异指纹图谱的乳腺癌检测方法。

技术介绍

[0002]乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位列我国女性恶性肿瘤的第一位和第四位。2015年我国女性乳腺癌新发病例约30.4万例，占女性全部恶性肿瘤发病的17.1％；死亡病例约7.0万例，占女性全部恶性肿瘤死亡的8.2％。由于乳腺癌发病隐匿，早期乳腺癌的症状多不明显，常被忽视。临床中初诊病例以晚期乳腺癌居多，晚期乳腺癌可发生癌细胞远处转移，出现全身多器官病变，直接威胁生命，因此早筛早诊是延长乳腺癌患者生存期的前提。
[0003]临床常用的筛查手段包括血清肿瘤标志物的检查和影像学检查。但是这两种筛查手段均存在一定的局限性，如血清肿瘤标志物中癌胚抗原(CEA)是一种广谱的肿瘤标志物，在晚期乳腺癌患者中的阳性率仅有70％，早期患者更低；糖链抗原153(CA153)是乳腺癌诊断的特异度肿瘤标志物，但在早期乳腺癌诊断的敏感性较低，且在某些乳腺癌患者中表达阴性；糖链抗原125(CA125)属于上皮性卵巢抗原的糖蛋白，在乳腺癌患者血清中的阳性率仅有24％。影像学检查手段中磁共振成像(MRI)诊断乳腺癌的敏感性为88％～100％，但是特异性仅为72％，容易误诊；乳腺超声检测对早期乳腺癌胃钙化等情况容易漏诊，且可靠性受操作者影响；钼靶检查广泛用于乳腺癌的筛查，但当乳房高密度时，钼靶对癌症肿块与非癌症的区分较为困难。上述诊断方法都有自身的局限性，目前急需探索出用于辅助诊断乳腺癌并具有较高灵敏度和特异度的新型无创性的方法。
[0004]蛋白质糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质肽链上的天冬酰胺(ASN)的胺基形成N
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连接聚糖或苏氨酸/丝氨酸的羟基氧原子形成O连接聚糖，参与调控蛋白质的功能。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。蛋白质上N
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糖链通过加工修饰来调控蛋白质的结构，稳定性和活性，所以糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能起重要作用，从而赋予糖蛋白具有多种生物功能。因此了解糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。
[0005]目前己经在多种肿瘤中发现了蛋白质N
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糖链的异常改变，而N
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糖链的末端唾液酸修饰改变是其中之一。唾液酸是一类带负电荷的9碳糖化合物，广泛存在于生物体内，常位于聚糖链末端；其在唾液酸酶的作用下通过α
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2,3或α
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2,6糖苷键与糖链上的半乳糖或N
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乙酰半乳糖胺连接形成聚唾液酸链。研究发现聚糖链末端的唾液酸在调控细胞的相互识别、分子相互作用、病毒感染、免疫响应以及信号传导起到重要的功能，且细胞表面糖蛋白质唾液酸修饰具有组织和细胞特异性。众多研究表明唾液酸修饰异常导致了多种疾病的发生发展，如感染性疾病的发生、以及肿瘤的浸润和转移有着密切关系。因此，检测唾液酸相关寡糖链的改变对乳腺癌辅助诊断具有潜在的临床价值。

技术实现思路

[0006]针对目前临床上使用的乳腺癌检测中存在的问题，如血清学标志物CEA、CA153和CA125在早期癌症中的敏感性较低，影像学方法存在误诊、漏诊以及受乳房密度的影响等。本专利技术提供一种乳腺癌检测试剂，通过该试剂测定血清中的天然寡糖N
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糖组图谱，再将峰值量化并进行统计学分析，从而提供一种乳腺癌的血清天然寡糖N
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糖组图谱模型的建立方法，通过测定生理病理状态下蛋白质的天然糖基化修饰的改变来检测乳腺癌。
[0007]本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]一种基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂，由以下试剂组成：
[0009]试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；
[0010]试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP
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40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；
[0011]试剂C：由8
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氨基芘
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1,3,6
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三磺酸溶于DMSO中配制而成浓度为0.02mM～1M有机物还原剂；
[0012]试剂D：终止液。
[0013]优选的，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比为1:1:1。
[0014]优选的，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积都为5μl。
[0015]优选的，所述试剂D为超纯水。
[0016]一种基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0017]步骤一寡糖链的制备
[0018]在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂A，进行变性，冷却至室温后，加入5μl试剂B，37℃反应3h，然后进行干燥；
[0019]步骤二寡糖链的标记
[0020]在步骤一干燥后得到的样品中加入5μl试剂C，60℃反应1h后进行荧光标记，然后加入100μl试剂D终止标记反应；
[0021]步骤三寡糖链分离分析
[0022]取10μl寡糖链标记后的液体，用分析仪进行N
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寡糖链分离检测，得到天然寡糖N
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糖组图谱；
[0023]步骤四数据处理分析
[0024]N
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糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
[0025]一种组合物在制备寡糖链乳腺癌检测试剂中的应用，所述组合物由血清中的G4S4、G3S3、G2S2、G2S2F、G2S1、G2S1F、G1F和G2F2组成，所述组合物通过(G1S1F+G1F)/G3S3的值来检测乳腺癌。
[0026]所述G1F为同分异构体。
[0027]本专利技术提供一种乳腺癌的血清天然寡糖N
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糖组图谱模型的建立方法，通过测定血清天然寡糖链G
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Test特异指纹图谱，进行统计学分析。
[0028]材料和方法：
[0029]一、检测样本：健康人和乳腺癌患者的血清。
[0030]二、实验设备：毛细管电泳分析仪，PCR，离心机。
[0031]三、试剂制备：
[0032]1、试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；
[0033]2、试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP
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40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；
[0034]3、试剂C：由8
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂，其特征在于，由以下试剂组成：试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP
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40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；试剂C：由8
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氨基芘
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1,3,6
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三磺酸溶于DMSO中配制成浓度为0.02mM～1M有机物还原剂；试剂D：终止液。2.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比是1:1:1。3.根据权利要求2所述的基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积都为5μl。4.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂，其特征在于，所述试剂D为超纯水。5.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂的制备方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翠英，李维泉，张军利，傅婷婷，徐蕾，
申请(专利权)人：江苏先思达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：