溶瘤病毒、PARP抑制剂及PD-1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种溶瘤病毒、PARP抑制剂及PD

【技术实现步骤摘要】
溶瘤病毒、PARP抑制剂及PD
‑
1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及溶瘤病毒、PARP抑制剂及PD
‑
1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用

技术介绍

[0002]具有独特溶瘤机制的溶瘤病毒为肿瘤的治疗提供了一种新的选择，特别是对于一些常规治疗无响应的肿瘤，溶瘤病毒在肿瘤细胞中复制可以裂解杀伤肿瘤细胞，此外，溶瘤病毒以及裂解释放的肿瘤相关抗原可诱导免疫应答进一步杀伤肿瘤。
[0003]由于肿瘤异质性和肿瘤微环境的复杂性以及机体免疫系统的影响，单一使用溶瘤病毒在某些肿瘤中难以取得良好的治疗效果，例如首个获得FDA批准的溶瘤病毒T
‑
VEC并不能提升黑色素瘤患者的整体存活率，仅有16.3％接受治疗的患者肿瘤体积在6个月内会持续缩小。这极大的影响的溶瘤病毒的适应症。
[0004]溶瘤病毒与其他药物联合使用可以实现优势互补，从而提高肿瘤治疗效果。例如Amgen公司与百时美施贵宝合作开展T
‑
VEC与CTLA
‑
4抗体联合治疗晚期黑色素瘤I期临床结果表明联合治疗的整体应答率显著高于单一药物治疗。另外也文献报道组蛋白去乙酰化酶抑制剂和抗肿瘤血管生成抑制剂等可协同增强单纯疱疹病毒类溶瘤病毒抗肿瘤治疗效果。
[0005]中国专利201711478207.X公开一种甲病毒属的M1溶瘤病毒与PARP抑制剂的联合使用，在细胞水平具有提高杀伤肿瘤细胞的功能。该专利是将溶瘤病毒和 PARP抑制剂在体外对肿瘤细胞进行杀伤，没有进行体内实验，即在最能反映实际临床情况的动物模型中进行验证，同时对溶瘤病毒的使用数量使用次数使用时间和 PARP抑制剂的使用数量使用次数使用时间没有进行探究，另对溶瘤病毒和PARP 抑制剂使用后，机体免疫情况的变化也没有进行探究，而这些问题在本方案中均得到了解决。且该专利文献也没有提及与PD
‑
1抗体的联合使用的技术方案。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一在于提供一种抗肿瘤药物组合物，所述组合物包括溶瘤病毒和 PARP抑制剂，所述溶瘤病毒选自I型单纯疱疹病毒。
[0007]作为本专利技术的一个实施方式，所述PARP抑制剂为Olaparib，所述Olaparib的分子式为C
24
H
23
FN4O3；所述Olaparib的结构式所如式Ι示：
[0008][0009]本专利技术采用PARP抑制剂为Olaparib，Olaparib能够同时抑制PARP1和PARP2的活
性，且Olaparib为批准用于临床治疗的药物，安全性和可靠性均已验证。所述组合物还包括PD
‑
1抗体。所述PD
‑
1抗体是针对于人源PD
‑
1和鼠源PD
‑
1的单克隆或多克隆抗体。
[0010]所述溶瘤病毒为在I型单纯疱疹病毒中插入miRT124和hGMCSF制备而得。所述溶瘤病毒通过包括如下步骤的方法制备获得：
[0011]S1.分别扩增HSV
‑
1、ICP34.5基因的两端序列；
[0012]S2.使用同源重组的方法，将hGM
‑
CSF、CMV
‑
GFP、4xmiRT124和ICP34.5两端序列，以及质粒pCMV
‑
GFP连接起来，形成完整的供体质粒，记为pUL34.5
‑
hGM
‑
CSF
‑ꢀ
lox2272
‑
CMV
‑
eGFP
‑
lox2272
‑
4xmiRT124；
[0013]S3.设计针对ICP34.5区域的sgRNA，并通过酶切连接的方式连接至Lenti
‑
CRISPR
‑ꢀ
V2载体上，记为Lenti
‑
CRISPR
‑
ICP34.5；
[0014]S4.将供体质粒pUL34.5
‑
hGM
‑
CSF
‑
lox2272
‑
CMV
‑
eGFP
‑
lox2272
‑
4xmiRT124和靶向 ICP34.5的Lenti
‑
CRISPR
‑
ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞，待细胞完全病变后，收取培养上清；将上清加入至Vero细胞中，数小时后，观察荧光蚀斑，并挑取荧光蚀斑；获得插入了hGMCSF、CMV
‑
GFP、4xmiRT124的HSV
‑
1，记为oHSV
‑
GFP；
[0015]S5.以带有Cre片段的质粒为模板，扩增Cre片段，并通过酶切连接的方法连接至 pCCL
‑
PGK
‑
eGFP载体上，记为pCCL
‑
PGK
‑
eGFP；
[0016]S6.将步骤S5制备的pCCL
‑
PGK
‑
Cre质粒转染HEK293T细胞，以MOI＝1.0的剂量加入步骤S4制备的oHSV
‑
GFP，待细胞完全病变后，收取培养上清；将上清加入至 Vero细胞中，观察无荧光蚀斑，并挑取无荧光蚀斑；获得插入了hGMCSF和4xmiRT124 的HSV
‑
1，记为oHSV。
[0017]优选的，步骤S4具体包括如下步骤：
[0018]将供体质粒pUL34.5
‑
hGM
‑
CSF
‑
lox2272
‑
CMV
‑
eGFP
‑
lox2272
‑
4xmiRT124和靶向ICP34.5的Lenti
‑
CRISPR
‑
ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI＝1.0 的剂量加入HSV
‑
1，待细胞完全病变后，收取培养上清；以10倍比稀释的方法，将上清加入至Vero细胞中，48小时后，观察荧光蚀斑，并挑取荧光蚀斑；以上述方法经过多轮纯化，获得插入了hGMCSF、CMV
‑
GFP、4xmiRT124的HSV
‑
1，记为oHSV
‑
GFP。
[0019]优选的，步骤S5具体包括如下步骤：
[0020]将步骤S5制备的pCCL
‑
PGK
‑
Cre质粒转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI＝1.0 的剂量加入步骤S4制备的oHSV
‑
GFP，待细胞完全病变后，收取培养上清；10倍倍比稀释的方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包括溶瘤病毒和PARP抑制剂，所述溶瘤病毒选自I型单纯疱疹病毒，所述PARP抑制剂为Olaparib，所述Olaparib的分子式为C
24
H
23
FN4O3；所述Olaparib的结构式所如式Ι示：2.根据权利要求1所述抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述溶瘤病毒为在I型单纯疱疹病毒中插入miRT124和hGMCSF制备而得。3.根据权利要求1所述抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述溶瘤病毒的用量为10
×
107‑
100
×
107PFU、所述Olaparib的用量为100
‑
1000mg/kg。4.根据权利要求1所述抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述组合物还包括PD
‑
1抗体。5.根据权利要求4所述抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述PD
‑
1抗体的用量为450μg
‑
750μg。6.根据权利要求1中任一项所述抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述溶瘤病毒通过包括如下步骤的方法制备获得：S1.分别扩增HSV
‑
1、ICP34.5基因的两端序列；S2.使用同源重组的方法，将hGM
‑
CSF、CMV
‑
GFP、4xmiRT124和ICP34.5两端序列，以及质粒pCMV
‑
GFP连接起来，形成完整的供体质粒，记为pUL34.5
‑
hGM
‑
CSF
‑
lox2272
‑
CMV
‑
eGFP
‑
lox2272
‑
4xmiRT124；S3.设计针对ICP34.5区域的sgRNA，并通过酶切连接的方式连接至Lenti
‑
CRISPR
‑
V2载体上，记为Lenti
‑
CRISPR
‑
ICP34.5；S4.将供体质粒pUL34.5
‑
hGM
‑
CSF
‑
lox2272
‑
CMV
‑
eGFP
‑
lox2272
‑
4xmiRT124和靶向ICP34.5的Lenti
‑
CRISPR
‑
ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞，待细胞完全病变后，收取培养上清；将上清加入至Vero细胞中，数小时后，观察荧光蚀斑，并挑取荧光蚀斑；获得插入了hGMCSF、CMV
‑
GFP、4xmi...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇伽，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：