二硫键肽的生产制造技术

本发明专利技术提供了一种制备二硫键肽的方法和设备，其中一种氧化剂溶液和一种肽溶液被同时加入至一反应容器，所述肽包含至少两个巯基，在同时添加氧化剂溶液和肽溶液期间，所述反应容器内的氧化剂的平均浓度基本为零。容器内的氧化剂的平均浓度基本为零。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】二硫键肽的生产
[0001]总体上本专利技术涉及工业或实验室规模的肽合成领域，公开了一种改进的肽制备的方法，用于制备包含至少一个分子内二硫键的肽，特别是用于制备包含一个或多个胱氨酸残基的肽。本专利技术涉及有效率地制备此类肽的方法。二硫键存在于许多肽中，通常对肽活性至关重要，因为它们可以稳定肽的三级结构。因此，二硫键肽的化学合成具有相当大的商业重要性。
[0002]一般性地，肽的化学合成是本领域公知的，通常从肽的C端到N端进行(参见手册《固相肽合成Bachem
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肽的先驱合作伙伴》(Solid Phase Peptide Synthesis Bachem
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Pioneering Partner for Peptides)，由Global Marketing,Bachem集团出版，2014年6月)。在合成过程中，应该使第一个氨基酸的α氨基和第二个氨基酸的α羧基之间的肽键的形成比意外的副反应更容易，这通常是通过使用合适的保护基团来实现。
[0003]肽的化学合成可划分为两种标准方法，即液相肽合成(LPPS)和固相肽合成(SPPS)。除了LPPS和SPPS之外，还可以使用混合方法，首先通过上述技术之一合成其片段，然后使用另一种方法将这些片段连接在一起。
[0004]最流行的SPPS形式是称之为Fmoc SPPS的方法，其依赖于使用9
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芴基甲氧羰基(Fmoc)作为临时氨基保护基团。不断增长的肽链通过其C端氨基酸锚定在不溶性聚合物树脂上，通过连续添加构成其序列的由Fmoc保护的氨基酸来合成肽。
[0005]循环连续地添加氨基酸，每个循环包括：a)从连在树脂的肽上切割Nα
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保护Fmoc基团，b)进行洗涤步骤，c)偶联以保护氨基酸，以及d)再洗涤，然后通常从固体支持物上切割肽，去除保护基团，并分离肽。
[0006]二硫键肽的合成通常包括首先合成全长肽序列，然后形成分子内二硫键。在后一步中，分子内反应与分子间二硫键的形成竞争，导致二硫键二聚体和多聚体作为副产物。已经有几种策略，用于抑制这些不需要的副反应。
[0007]例如，美国专利5,656,721公开了一种方法，该方法是在从固体载体上裂解之前，用过氧化氢对SPPS树脂进行氧化。然而，这种假稀释方法可能会导致二硫键在随后的脱保护和从固体支持物上裂解的过程中发生副反应。此外，监测树脂上的氧化反应比监测溶液中的氧化反应要求更高，且该方法的重复性的关键取决于树脂负载和溶胀操作的重复性。据报道，一种变换的做法是将氧化剂固化在固体支持物上(Postma和Albericio，2014)。然而，这是个高成本的方法并且可能会导致敏感氨基酸的氧化。
[0008]最常见的策略是在非常稀的肽溶液中进行氧化反应。通常将氧化剂(例如碘)加入到所述肽溶液中以引发反应。替代性地，美国专利4,216,141披露了一种方法，其中将含有至少两个半胱氨酸残基的肽以约0.5至10g/l的浓度溶解在酸化水溶液中，再将肽溶液逐渐添加到含有氧化剂的缓冲溶液中。添加时的反应条件使得在反应混合物中巯基
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即线性肽
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的浓度在反应过程中基本保持为零。同样，等人(Methods in Enzymology,289卷,198
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221页,1997)公开了一种形成二硫键的方法，其中将稀释的肽溶液(游离硫醇形式，0.1
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10mM)，在氮气下，缓慢加入到10mM的K3Fe(CN)6水溶液中(氧化剂过量20％)。
[0009]然而，上述方法的工业扩展性(scalability)是有限的，因为它需要处理不切实际
的大量肽溶液。在需要避免在Trp或Met侧链上产生副反应时，Misicka和Hruby(Polish J.Chem.,68,893
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899,1994)提出了一种方法，同时添加肽溶液和氧化剂溶液，并以相同的速率加入反应混合物，从而生成含有稳定、最佳比例的两种离析物的反应溶液。为了在不影响产品质量的情况下减少溶剂的使用，Ormerod等人(Org.Process Res.Dev.2015,19,841
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848；WO 2016/042066；WO 2013/156600)提出了在氧化反应完成后使用纳滤(nanofiltration)和渗透物的再循环。Marchetti等(“可持续纳米技术与环境：进展与成就”，2013年，第1124卷，第121
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150页)提出将膜过滤应用于肽片段缩合反应。
[0010]然而，本领域仍然需要一种简单、可靠、可工业扩展，以及成本有效性高的方法来产生适合工业规模应用的二硫键合肽(disulfide bonded peptides)。
[0011]本专利技术人惊奇地发现了这样一种方法，其中将高浓度的肽溶液和氧化剂溶液同时加入反应混合物中。在这种添加过程中，形成二硫键的氧化反应基本上是立即发生，并且在添加期间氧化剂的浓度保持基本恒定且处于基本等于零的水平。这与现有技术的教导相反，通常要求氧化剂在反应开始时过量使用。在根据本专利技术的程序中，在肽添加完成后继续添加氧化剂，这可能导致添加结束时氧化剂过量。出乎意料的是，与Misicka和Hruby教导的避免氧化剂过量相反，本专利技术人没有观察到Trp侧链的过度氧化。本专利技术的方法和装置出人意料地允许产生高质量和高浓度的二硫键合肽。据信这是通过在氧化反应的整个时间内精确控制反应条件来实现的，当然，本专利技术不应受此理论的束缚。
[0012]一般性地，本申请通篇使用了如下缩写和定义：
[0013]Acm 乙酰氨基甲基
[0014]Boc tert.丁氧羰基
[0015]Bzl 苄基
[0016]Dpm 二苯甲基
[0017]DTE 二硫赤藓醇
[0018]DTT 二硫苏糖醇
[0019]EDT 1,2
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乙二硫醇
[0020]Fmoc 9
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芴基甲氧羰基
[0021]LPPS 液相肽合成
[0022]Mmt 甲氧基三苯甲基
[0023]Mtt 甲基三苯甲基
[0024]Phacm 苯乙酰胺甲基
[0025]SPPS 固相多肽合成
[0026]StBu tert.丁基巯基
[0027]tBu tert.丁基
[0028]TFA 三氟乙酸
[0029]TIPS 三异丙基硅烷
[0030]Trt 三苯甲基
[0031]除非另有说明，pH值是指相应水溶液在其使用温度下的值。除非另有说明，术语“约”是指给定数值的正负10％的偏差。
[0032]根据WIPO标准，氨基酸指称时，其全名(例如：丙氨酸)与3字母代码(例如Ala)或1
字母的代码(例如A)互换使用。对于对映体，在没有明确指定时，通常指L
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氨基酸。然而，应当理解，本专利技术也同样可以实施于D
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备肽的方法，所述肽具有至少一个分子内二硫键，该方法包括：a)提供液体反应介质至反应容器，所述容器可混合其内容物；b)提供肽的溶液，所述肽包含至少两个巯基；c)提供氧化剂溶液；d)通过空间分离的入口，将所述氧化剂溶液和所述肽溶液同时添加到反应容器内的所述反应介质中，同时混合反应容器的内容物，其中在进行添加期间：i)浓度C1低于浓度C0，所述C1为反应容器内还原状态的所述肽的平均浓度，所述C0为肽添加结束时反应容器内所有肽的最终浓度，无论其氧化态；和ii)在同时加入氧化剂和肽的期间，所述反应容器内氧化剂的平均浓度基本保持为零；以及e)在肽添加结束后继续添加氧化剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中加入到反应容器中的氧化剂的总量对应于所述肽完全氧化后所含的二硫键总量的1.0至1.5当量。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤d)和e)交替重复至少一次。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，进一步包括，在完成步骤e)之后，一步除去包含在反应容器中的任何过量氧化剂的步骤，优选地，通过添加合适的还原剂来实现所述的除去。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过搅拌器、气泡、液体循环或其任意组合以实现所述反应容器内容物的混合。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，将低分子量物质从反应容器的内容物中除去，优选通过膜过滤进行除去。7.根据权利要求6中任一项所述的方法，其中所述膜过滤与步骤d)同时进行。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述氧化剂溶液的流量由监测系统产生的反馈信号控制，优选地，所述监测系统是反应容器内的氧化还原电位探针，其中所述监测系统优选位于反应容器、滞留物回路和/或旁路回路。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，进一步包括纯化处于氧化态的肽的步骤，优选通过制备色谱法。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述氧化剂选自碘、...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：巴克姆股份公司，
类型：发明
国别省市：