一种细菌漆酶变构体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种细菌漆酶变构体及其制备方法，其中还公开了相应核酸序列以及包含有该序列的工程菌；本发明专利技术通过在特定的序列位点进行删除相应序列或缺失片段，更为具体的为删除了序列中形成MR螺旋和R

【技术实现步骤摘要】
一种细菌漆酶变构体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程和酶工程领域，尤其涉及高表达量的细菌漆酶变构体及其制备方法。

技术介绍

[0002]漆酶，一种含多个铜离子的多酚氧化酶，主要以单体糖蛋白的形式存在。漆酶有着广泛的催化底物谱，能够催化氧化酚类和芳香族化合物，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保催化剂。此外，还能和其他酶协同催化，是最具有潜力的工业酶制剂。漆酶可以用于食品加工、纸浆漂白和绿色合成等工业领域，具有广阔的应用价值。在自然界中，漆酶的来源广泛，在真菌、细菌、植物和动物中都发现了漆酶，不同物种来源的漆酶功能相似。其中，细菌来源的漆酶相对于其他漆酶，具有生长周期短、热稳定性好且pH范围宽等优势，更适合大规模工业化应用。然而，目前有关提高细菌来源漆酶活性和表达量的方法甚少，因此，对提高细菌漆酶活性和表达量的研究具有重要研究意义和实际应用价值。定向改造策略是对蛋白质进行多轮积累、连续突变、表达、筛选，从而引导蛋白质的表达朝人们需要的方向进行的手段。它是目前应用最广泛的蛋白质改造手段，但其筛选时间长、工作量大、且突变随机不可预测，影响蛋白质改造效率。随着结构生物学和计算生物学的快速发展，计算机模拟辅助酶改造通过分析蛋白序列、结构与功能之间的关系，预测基因改造范围与位点，可显著增加有效变构体的比例，大大缩短实验周期。许多研究表明，通过计算机辅助的理性设计，酶分子改造能够显著提高酶的催化特性，并能够显著降低建立、筛选变构体文库所需的工作量。
[0003]然而，定点改造技术只集中在对蛋白质分子的小范围改造，特别是点突变。随着对蛋白质折叠以及蛋白质结构认识的深入，人们不断探索通过对蛋白酶结构域基因进行改造，发现结构域改造后酶的酶活、表达量以及其他特性均有显著改善。目前，计算机辅助设计改在漆酶结构域基因主要针对脱氢酶、纤维素酶、甘露聚糖酶等，目前仍鲜有通过基因结构域优化改造提升漆酶活性和表达量的专利报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种细菌漆酶变构体、相关序列、工程菌及其制备方法。
[0005]本专利技术是通过以下的技术方案来实现的。
[0006]一种细菌漆酶变构体，所述细菌漆酶变构体的氨基酸序列相较于SEQ ID NO.1所示的野生型细菌漆酶的氨基酸序列存在至少一个缺失片段；所述缺失片段被移除后，不改变由His443，Cys500和His505所形成的Cu1的空间结构。
[0007]优选地，所述的缺失片段为野生型细菌漆酶中的形成R
‑
loop结构或MR螺旋的氨基酸序列。
[0008]优选地，所述缺失片段的位置为SEQ ID NO.1所示的野生型细菌漆酶的氨基酸序列的61
‑
68、128
‑
140、198
‑
206、256
‑
264、313
‑
322或373
‑
385号位中的任意一个位点。
[0009]优选地，所述细菌漆酶变构体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2
‑
SEQ ID NO.9所示序列的任意一种。
[0010]本专利技术还提供了一种编码前述的细菌漆酶变构体的核酸序列。
[0011]优选地，所述的核酸序列为SEQ ID NO.11
‑
SEQ ID NO.18所示序列的任意一种。
[0012]本专利技术还提供了一种工程菌所述的工程菌中含有前述述的核酸序列和/或包含有所述的细菌漆酶变构体。
[0013]本专利技术还提供了一种细菌漆酶变构体的制备方法，包括以下步骤：
[0014]步骤1、获取序列：以大肠杆菌来源的漆酶CueO的晶体结构为原型，通过Autodock Vina、RosettaFold、PyMOL、Procheck软件进行蛋白质辅助设计，得到细菌漆酶变构体、序列结构与基因序列；
[0015]步骤2、合成漆酶基因：根据宿主菌株的密码子偏爱，合成得到含偏爱密码子优化的细菌漆酶变构体的基因的克隆载体质粒pUC
‑
GW
‑
Kan及其宿主菌株；
[0016]步骤3、提取漆酶基因模板：对含克隆载体质粒的宿主菌株进行培养、收集，提取质粒，得到含细菌漆酶变构体的基因模板的载体pUC
‑
GW
‑
Kan；
[0017]步骤4、构建重组载体：通过酶切连接法将细菌漆酶变构体的基因与pET28a+质粒连接构建重组载体，得到重组载体；
[0018]步骤5、构建重组菌株：将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，得到重组菌株；
[0019]步骤6、诱导培养：用异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养重组菌株，并加入硫酸铜(CuSO4)进一步培养，并提取蛋白；
[0020]步骤7、漆酶活性的测定：使用ABTS法测定漆酶活性。
[0021]优选地，步骤5所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21 DE3菌株，所述菌株又称为大肠杆菌BL21(D3)菌株。
[0022]漆酶的催化机理为Cu1位于酶的活性中心可以结合底物，成为电子的接收者并将电子转移到Cu2上，将活性中心的氧分子还原成水。因此本专利技术选择了远离Cu1离子的位点进行删减，如61
‑
68、128
‑
140、198
‑
206、256
‑
264、313
‑
322号位；可以根据电脑模拟出模型试错得出以下位点被删减不会影响到活性中心。R
‑
loop的存在会影响到蛋氨酸丰富的螺旋结构(MR)，与MR螺旋通过亲水和疏水相互作用牵引在一起，阻碍了底物进入活性中心的通道，先前本专利技术已经将MR螺旋进行了删减，在此基础上再对R
‑
loop(氨基酸序列在373
‑
385)进行删减，将运输通道打开，有利于大分子底物进入对接部位。同时又不影响对接区域，因此本专利技术简化了该结构。除此之外，本专利技术还大胆尝试了将198
‑
206号氨基酸进行删减，将结合位置进一步打开，更有利于大分子底物结合，但可能对小分子底物的结合产生不利影响。
[0023]与其他多铜氧化酶一样，漆酶CueO的晶体结构的重要特征是四个Cu离子排列在两个位置，分成三类，分别为Cu1(位于His443，Cys500和His505所形成的空间之间)，Cu2和两个Cu3，后三者形成TNC三簇结构。Cu1位于底物结合部位，当底物被氧化后，能够将电子传递给Cu1，Cu1再将电子由单核中心通道向氧分子结合中心传递。Cu2和Cu3位于氧分子结合部位，此部位为TNC三簇结构，氧分子最后接受电子生成水。传统的方法主要是对蛋白酶序列的C端和/或N端进行删除，然而由于漆酶CueO的C端和N端是构成其活性的主要组成氨基酸，故不能采用传统方法。本专利技术在进行删减时的原则是保留活性中心，以及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细菌漆酶变构体，其特征在于：所述细菌漆酶变构体的氨基酸序列相较于SEQ ID NO.1所示的野生型细菌漆酶的氨基酸序列存在至少一个缺失片段；所述缺失片段被移除后，不改变由His443，Cys500和His505所形成的Cu1的空间结构。2.根据权利要求1所述的细菌漆酶变构体，其特征在于：所述的缺失片段为野生型细菌漆酶序列中形成R
‑
loop结构或MR螺旋的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的细菌漆酶变构体，其特征在于：所述缺失片段的位置为SEQ ID NO.1所示的野生型细菌漆酶的氨基酸序列的61
‑
68、128
‑
140、198
‑
206、256
‑
264、313
‑
322或373
‑
385号位中的任意一个位点。4.根据权利要求1所述的细菌漆酶变构体，其特征在于：所述细菌漆酶变构体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2
‑
SEQ ID NO.9所示序列的任意一种。5.一种编码如权利要求1
‑
4任一项所述的细菌漆酶变构体的核酸序列。6.根据权利要求5所述的核酸序列，其特征在于：所述的核酸序列为SEQ ID NO.11
‑
SEQ ID NO.18所示序列的任意一种。7.一种工程菌，其特征在于：所述的工程菌中含有权利要求5中所述的核酸序列。8.一种工程菌，其特征在于：所述的工程菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰善红，刘金环，胡俊杰，吕小梅，
申请(专利权)人：东莞理工学院，
类型：发明
国别省市：