一种准确检测新生隐球菌的方法技术

本申请涉及一种用于检测新生隐球菌的引物探针组合、试剂盒及检测方法，其中，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的物质。本申请能够快速准确地检测出新生隐球菌。快速准确地检测出新生隐球菌。快速准确地检测出新生隐球菌。

【技术实现步骤摘要】
一种准确检测新生隐球菌的方法
[0001]本申请是申请日为2020年11月11日、申请号为202011254571.X、名称为“一种准确检测新生隐球菌的方法”的专利技术申请的分案申请。


[0002]本专利技术属于真菌病原学检测
，具体涉及一种准确检测新生隐球菌的方法。

技术介绍

[0003]隐球菌是一种病菌，可导致隐球菌病。媒介一般为干的鸽子粪，鲜有人与人之间传播的报告。尚无特效药，一般进行对症处理。隐球菌病是由隐球菌引起的肺部或播散性感染性疾病，主要引起肺炎和脑膜炎，也引起皮肤、骨骼或内脏器官感染。临床上结合临床表现以及显微镜检查结果进行诊断，再通过真菌培养或组织染色加以确认。临床上治疗药物包括两性霉素B、三唑类抗真菌药物和氟胞嘧啶。
[0004]新生隐球菌(Cryptoccus neo formans)属于隐球菌属(Cryptococcus)。新生隐球菌为酵母型真菌，外包一层多糖组成的肥厚荚膜，一般染色法不着色，难以发现，故称为隐球菌。新生隐球菌在自然界分布广泛，鸽粪中最多见。人在免疫力低下时，因吸入鸽粪污染的空气而感染，主要引起肺和脑亚急性或慢性感染。肺部作为原发病灶，可扩散至脑部感染，引起慢性炎症和脓肿。新生隐球菌及其变种具有致病性，主要侵犯中枢神经系统。新生隐球菌系环境腐生菌，广泛生存于土壤和鸽粪中。正常人常处于新生隐球菌污染的环境中，但发病者极少。当机体抵抗力降低时，才易侵入人体而致病。由于肿瘤及化疗药物的使用、艾滋病的流行、移植术后免疫抑制药物的使用等原因，新生隐球菌的发病率越来越高，在国外已成为艾滋病患者常见的并发症之一，也是导致患者死亡的重要原因。在我国新生隐球菌的发病率也呈逐年增加的趋势。
[0005]新生隐球菌无论在组织内或人工培养条件下均呈现圆形的酵母样细胞，其外周有一层较厚的胶质样荚膜，称厚荚膜。菌体直径4
‑
20μm，荚膜宽3
‑
5μm，菌体内有一个或多个反光颗粒，为核结构。部分菌体可见出芽。临床和环境分离菌株一般为无性期的酵母相生长。1976年Kwon
‑
Chung发现新生变种的有性期，在有性期生长可见菌丝形成。培养诱导实验是观察隐球菌有性期的主要方法。非致病性隐球菌无荚膜。新生隐球菌在沙保培养基和血琼脂培养基上，于25℃和37℃均能生长，非致病性隐球菌则在37℃不能生长。培养数日形成酵母型菌落，表面黏稠，初为乳白色，后转变成橘黄色。此菌能分解尿素，可与假丝酵母菌区别。
[0006]由于隐球菌感染后仅根据临床表现容易误诊，病原学检测是诊断和治疗的主要依据。现阶段主要的隐球菌检测方法都存在局限性，其中，脑脊液墨汁染色可以初步观察隐球菌的形态，但敏感性低；隐球菌抗原试剂可以快速检测隐球菌抗原，但不能区分新生隐球菌和格特隐球菌；隐球菌培养鉴定也难以鉴定新生隐球菌和格特隐球菌。文献“新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定，冯晓博《中华皮肤科杂志》
2012年”建立了一种基于核糖体基因内间隔区(IGS)的多重聚合酶链反应(PCR)，用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌，该方法需要针对每一种菌设计引物，方法比较繁琐，反应不够快捷；专利“CN2017101725670”公开了一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒，属于医学真菌学的领域。根据隐球菌的靶基因，设计该检测隐球菌基因的引物序列如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.6与SEQ ID No.7所示，其中SEQ ID No.3与SEQ ID No.4对应于新生隐球菌，SEQ ID No.6与SEQ ID No.7对应于格特隐球菌，可以在同一体系中用于特异性检测新生隐球菌与格特隐球菌两种隐球菌”，该方法只是将特异性扩增新生隐球菌和格特隐球菌引物和检测探针进行组合，创新性相对较低，而且两套扩增引物，成本更高，扩增反应相对繁琐。
[0007]因此，需要新的技术和方法来正确检测并鉴定新生隐球菌。

技术实现思路

[0008]本专利技术为了克服传统检测新生隐球菌的操作繁琐、灵敏度低、错误率高等缺陷，提供一种准确检测新生隐球菌的方法，该方法可以是诊断目的，也可以是非诊断目的。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。
[0010]一种准确检测新生隐球菌的方法，，其特征在于，所述方法包括如下步骤
[0011]步骤1)选择待测样本；
[0012]步骤2)提取DNA；
[0013]步骤3)制备实时荧光PCR反应体系；
[0014]步骤4)荧光PCR扩增。
[0015]进一步地，所述荧光PCR反应体系包括引物和探针。
[0016]更进一步地，所述引物由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成；所述探针为检测新生隐球菌的探针。
[0017]优选地，所述探针为FAM
[0018]5’‑
TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC
‑3’
BHQ1。
[0019]更优选地，所述荧光PCR反应体系为：
[0020]ReagentsVoume(μL)10
×
ExTag Buffer2.5μLOriginal DNA1μLdNTP2μL探针(10nmol/ml)0.5μL上游引物(10nmol/ml)0.5μL下游引物(10nmol/ml)0.5μLTaKaraExTag enzyme(5U/μL)0.25μLUltrapure water17.25μL
[0021]另一方面，本专利技术还要求保护一种同时检测新生隐球菌和格特隐球菌的实时荧光PCR反应体系，所述实时荧光PCR反应体系为：
[0022][0023][0024]进一步地，所述引物由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成；所述探针1为检测新生隐球菌的探针，所述探针2为检测格特隐球菌的探针。
[0025]更优选地，所述探针1为FAM
[0026]5’‑
TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC
‑3’
BHQ1，所述探针2为HEX
[0027]5’‑
TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG
‑3’
BHQ1。
[0028]与现有技术相比较，本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几点：本专利技术通过基因组学方法比对数十个新生隐球菌和格特隐球菌基因组序列差异，选择保守序列和差异序列，设计出引物和探针，在进行检测和鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的过程中，具备敏感性高、特异性强的特点。另外，利用本专利技术试剂盒检测新生隐球菌和格特隐球菌时操作简单、检测时间短、适用性强的特点，本专利技术将检测新生隐球菌和格特隐球菌时所需的原料放在同一反应体系内，可同时检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，明确病原菌种类，帮助进行快速准确的临床早期诊断，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新生隐球菌的引物探针组合，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的物质。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，所述探针的5
’
端连接有荧光报告基团，3
’
端连接有荧光淬灭基团。3.根据权利要求1所述的引物探针组合，所述探针为FAM 5
’‑
TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC
‑3’
BHQ1。4.根据权利要求1所述的引物探针组合，所述引物特异性识别所述新生隐球菌中如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。5.一种用于检测新生隐球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1
‑
4中任一项所述的引物探针组合。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物的浓度为10nmol/mL，所述下游引物的浓度为10nmol/mL。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的浓度为10nmol/mL。8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，每25μL所述试剂盒的反应体系中包括0.5μL所述上游引物、0.5μL所述下游引物。9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，每25μL所述试剂盒的反应体系中包括0.5μL所述探针。10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：缓冲液，每25μL所述反应体系中包括2.5μL所述缓冲液。11.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：模板DNA，每25μL所述反应体系中包括1μL所述模板DNA。12.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：脱氧核苷三磷酸dNTP，每25μL所述反应体系中包括2μL所述dNTP。13.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：DNA聚合酶，每25μL所述反应体系中包括0.25μL所述DNA聚合酶。14.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：超纯水，每25μL所述反应体系中包括17.25μL所述超纯水。15.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为10

【专利技术属性】
技术研发人员：薛新颖，刘玉霞，赵晟，臧学磊，
申请(专利权)人：北京量觉科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：