一种可调控烟叶钾含量的NtYpi1基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，涉及调控烟叶钾含量的基因，具体涉及一种可调控烟叶钾含量的NtYpi1基因及其应用。本发明专利技术提供一种调控烟叶钾含量的NtYpi1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。还提供一种基于所述调控烟叶钾含量的NtYpi1基因的应用，通过CRISPR/cas9敲除该基因后烟叶钾含量与对照相比显著降低，可见NtYpi1基因参与了烟草钾含量的调控。本发明专利技术明确了NtYpi1基因对烟叶钾含量的调控功能，为解析烟草钾离子含量的分子调控提机制供了新的证据，也为通过基因表达调控培育钾含量提高的烟草提供新的思路，为通过分子手段提高烟叶钾含量提供了新的基因资源。钾含量提供了新的基因资源。

【技术实现步骤摘要】
Biological Chemistry,278(48),47744
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52.。
[0006]目前，在现有技术中，公开了具有Kelch样结构域的蛋白质磷酸酶在植物中的生长和发育的作用，如文献，Maselli Gustavo A,Slamovits Claudio H,Bianchi Javier I,Vilarrasa
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Blasi Josep,
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Delgado Ana I,Mora
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Garc
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a Santiago.Revisiting the evolutionary history and roles of protein phosphatases with Kelch
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like domains in plants.[J].Plant physiology,2014,164(3):，其主要是基于系统发育、功能和遗传证据重新评估了BSL(Brassinosteroid insensitive suppressor油菜素类固醇不敏感抑制剂)基因在拟南芥中的作用，特别强调了BSL1、BSL2和BSL3，进一步表明这三个基因在所有陆生植物中都高度保守；相比之下，BSU1型基因仅在十字花科中发现，并且具有异常发散的序列，这使它们在其他保守的家族中脱颖而出。
[0007]虽然现有技术公开了一些蛋白磷酸酶及抑制剂的在植物生长、发育以及进化的作用，还未见烟草蛋白磷酸酶抑制因子的克隆和研究的相关报道，也未见用于调控烟草中钾含量的报道。
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技术实现思路

[0008]为弥补上述领域存在的不足及空白，本专利技术为调控烟叶钾离子含量并克隆鉴定了一个烟草NtYpi1基因，CRISPR/cas9编辑该基因发现，该基因在调控烟草钾离子含量方面发挥功能；并提供了一种可调控烟叶钾含量的NtYpi1基因的应用。本专利技术研究结果对于解析烟草钾离子含量的分子调控具有重要的参考，也为通过基因表达调控培育钾含量提高的烟草提供新的思路。
[0009]本专利技术请求保护的技术方案如下：
[0010]一种可调控烟叶钾含量的NtYpi1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0011]一种可调控烟叶钾含量的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；或根据所述的NtYpi1基因编码为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白。
[0012]一种可调控烟叶钾含量的NtYpi1基因的应用，其特征在于，使用所述的NtYpi1基因或所述的蛋白在调控烟草钾离子含量中的应用。
[0013]一种利用CRISPR/cas9技术敲除所述NtYpi1基因编辑后的烟草，或通过过表达所述NtYpi1基因编辑后的烟草。
[0014]一种利用CRISPR/cas9技术编辑所述NtYpi1基因并测量编辑后的烟草钾含量的应用，包括以下过程：
[0015](1)根据所述NtYpi1基因的基因组序列设计靶位点为：
[0016]sgRNA:CGAAGAAGAAGAGCGTTTCA；
[0017](2)根据步骤(1)中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物的序列为：
[0018]P1：ATTGCGAAGAAGAAGAGCGTTTCA；
[0019]P2：AAACTGAAACGCTCTTCTTCTTCG；
[0020](3)根据步骤(1)中的所述靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物序列为：
[0021]NtYpi1
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SdF：ATGTGAATGCGTGTGGGTTCTT；
[0022]NtYpi1
‑
SdR：GCGATCCTCCGATTTACAGCAA；
[0023](4)制备dsDNA：根据步骤(2)中的所述的靶位点引物通过退火形成互补DNA oligo，得到dsDNA；
[0024](5)酶切pHSE401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤(4)中得到的dsDNA进行连接，得到连接产物；
[0025](6)测序验证：将步骤(5)中得到的连接产物转化为大肠杆菌，筛选阳性克隆并进行菌落PCR检测；经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到所述CRISPR/cas9载体。
[0026](7)获得编辑材料：利用叶盘法将所述CRISPR/cas9载体转化野生型烟草，利用步骤(3)中的检测引物扩增编辑材料，通过测序获得发生突变材料，突变材料自交后获得纯合突变株系；
[0027](8)测定钾含量：将步骤(7)中的纯合突变体种植于温室，在烟草株开花期，取叶位叶片来检测烟叶钾含量。
[0028]优选的，在第(4)步制备dsDNA时，具体反应体系为：包括P1 20μL，P2 20μL，10
×
Annealing buffer 5μL，灭菌双蒸水5μL；退火程序为：95℃，5min；90℃，1min；80℃，1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min；20℃，1min；10℃，1min。
[0029]优选的，所述酶切产物制备过程包括：利用BsaI酶对pHSE401载体进行酶切，酶切体系包括：质粒5μL，10
×
buffer 5μL，Bsa I 2μL，灭菌双蒸水38μL；在37℃，酶切1h；酶切后对酶切产物进行电泳检测分析，11520bp条带即为所述酶切产物。
[0030]优选的，所述连接产物制备过程包括：利用T4DNA连接酶将所述酶切产物与步骤(4)所制备dsDNA进行连接；连接体系包括：所述酶切产物3μL，所述dsDNA产物10μL，T4 DNA buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，灭菌双蒸水4μL；在16℃，过夜连接反应，最终得到所述连接产物。
[0031]优选的，在所述第(6)测序验证步骤中，所述菌落PCR检测时，所用引物设计序列为:
[0032]U6
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26p
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F：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC；
[0033]U6
‑
26p
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R：AAACCGATTCATCGCAACCAATTC。
[0034]优选的，在所述步骤(7)获得编辑材料中，所述叶盘法包括：将得到的所述CRISPR/cas9载体先通过农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆；再进行烟草转化，将得到的所述含有目标载体的农杆菌克隆培育得到含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液，加入切片后的无菌野生型烟草叶进行培养后，将培养后的所述无菌野生烟草叶片转入分化培养基中进行培养；待芽长至3～5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株T0代转基因烟草幼苗，即所述CRISPR/cas9载体转化后的野生型烟草。
[0035]优选的，在所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可调控烟叶钾含量的NtYpi1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。2.一种可调控烟叶钾含量的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；或根据权利要求1所述的NtYpi1基因编码为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白。3.一种可调控烟叶钾含量的NtYpi1基因的应用，其特征在于，使用权利要求1所述的NtYpi1基因或权利要求2所述的蛋白在调控烟草钾离子含量中的应用。4.一种利用CRISPR/cas9技术敲除权利要求1所述NtYpi1基因编辑后的烟草，或通过过表达权利要求1所述NtYpi1基因编辑后的烟草。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用CRISPR/cas9技术编辑所述NtYpi1基因并测量编辑后的烟草钾含量的应用，包括以下过程：（1）根据所述NtYpi1基因的基因组序列设计靶位点为：sgRNA: CGAAGAAGAAGAGCGTTTCA；（2）根据步骤（1）中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物的序列为：P1：ATTGCGAAGAAGAAGAGCGTTTCA；P2：AAACTGAAACGCTCTTCTTCTTCG；（3）根据步骤（1）中的所述靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物序列为：NtYpi1
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SdF：ATGTGAATGCGTGTGGGTTCTT；NtYpi1
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SdR：GCGATCCTCCGATTTACAGCAA；（4）制备dsDNA：根据步骤（2）中的所述的靶位点引物通过退火形成互补DNA oligo，得到dsDNA；（5）酶切pHSE401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤（4）中得到的dsDNA进行连接，得到连接产物；（6）测序验证：将步骤（5）中得到的连接产物转化为大肠杆菌，筛选阳性克隆并进行菌落PCR检测；经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到所述CRISPR/cas9载体；（7）获得编辑材料：利用叶盘法将所述CRISPR/cas9载体转化野生型烟草，利用步骤（3）中的检测引...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦芳婵，高玉龙，王丙武，赵璐，隋学艺，宋中邦，孔光辉，吴兴富，张谊寒，李永平，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：