一种烟草NtCCC1基因突变体及分子鉴定方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草NtCCC1基因突变体及分子鉴定方法和应用，所述烟草NtCCC1基因突变体为Ntccc1

【技术实现步骤摘要】
一种烟草NtCCC1基因突变体及分子鉴定方法和应用


[0001]本专利技术涉及植物分子生物学
，更具体地，涉及一种烟草NtCCC1 基因突变体及分子鉴定方法和应用。

技术介绍

[0002]氯离子含量是烟草中重要的质量参数，烟叶中的氯离子含量以0.3％～0.8％作为合适，如果烟叶中氯离子含量过高，会影响卷烟制品的燃烧性，会造成卷烟制品的阴燃，从而会使卷烟制品的烟气中具有更多的一氧化碳及焦油，这样会危害消费者的健康。并且当氯离子含量更高的时候，会直接造成熄火的现象。
[0003]目前我国在种植蔬菜和粮食作物的时候，会使用大量的化肥农药，现在的化肥中含量大量的氯离子，而这些含有氯离子的化肥在使用的过程中会造成耕作土壤中氯离子含量的超标。而土壤氯离子含量的超标会造成栽培作物过量的吸收氯离子从而造成作物体内的氯离子含量超标，这样会影响农作物的品质。
[0004]为解决烟叶氯离子含量偏高的问题，采用低氯含量化肥是最直接的手段，但是考虑到低氯化肥的生产成本要显著的高于高氯含量化肥，因此化肥生产厂家与农民考虑到成本的因素，往往不会使用低氯化肥而使用高氯离子含量的化肥。另外现在中国的耕作土壤中氯离子含量超标已经较为严重，即便现在开始使用低氯离子含量的化肥也不能很快的解决作物尤其是烟草中氯离子超标的问题；因此传统的农艺措施很难改变目前烟叶中氯离子超标的问题。
[0005]因此，鉴于以上情况，有必要研究一种烟草NtCCC1基因突变体及分子鉴定方法和应用以解决上述技术问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一个目的在于获得降低烟草烟叶中氯离子含量的烟草NtCCC1 基因突变体，第二个目的在于提供烟草NtCCC1基因突变体Ntccc1
‑
1的分子鉴定方法，第三个目的在于上述烟草NtCCC1基因突变体在降低烟草烟叶中氯离子含量的应用。
[0007]本专利技术的第一个目的是这样实现的，所述烟草NtCCC1基因突变体为 Ntccc1
‑
1，其为烟草NtCCC1基因第650位的T突变为A，形成终止密码子，使该基因提前终止；所述基因突变体Ntccc1
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
[0008]本专利技术的第二个目的是这样实现的，烟草NtCCC1基因突变体Ntccc1
‑
1的分子鉴定方法，所述突变体Ntccc1
‑
1的DNA片段是由以下引物对扩增得到，所述引物对的上游引物为NtCCC1 F，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；下游引物为NtCCC1 R，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0009]本专利技术的第三个目的是这样实现的，所述的烟草NtCCC1基因突变体 Ntccc1
‑
1在降低烟草烟叶中氯离子含量的应用。
[0010]本专利技术还提供一种NtCCC1基因突变体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0011]1、EMS诱变烟草种子：
[0012]先将烟草种子用次氯酸钠清洗消毒，然后用蒸馏水洗干；再将烟草植株用磷酸缓冲液浸泡，以增加种子的萌发率；将浸泡获得的烟草种子放置于0.5％的EMS(甲基磺酸乙酯)溶液中浸泡10
‑
15小时，然后进行离心滤干烟草种子。将离心滤干的烟草种子用蒸馏水漂洗50次，充分洗去EMS溶液，将EMS废液用氢氧化钠处理，以免造成污染。
[0013]2、筛选获得突变体植株：
[0014]首先提取突变体烟草DNA；以突变体材料的DNA为模板设计特异引物进行 PCR扩增；
[0015]上游引物为NtCCC1 F:ATTGTTTATATCGGTATCATCC
[0016]下游引物为NtCCC1 R：TGGGAGCATCCAACAGATCTA
[0017]将扩增获得的PCR产物进行测序分析，分析测序结果获得突变体材料，挑选提前终止的烟株为候选突变体材料；将所述候选突变体材料自交收种获得 M2种子；种植所述M2种子获得M2突变体植株，用上游引物NtCCC1 F和下游引物NtCCC1 R鉴定突变体，最终获得纯合突变植株；检测所述纯合突变体烟株中氯离子含量。
[0018]本专利技术的有益效果是：
[0019]1、本专利技术提供的烟草NtCCC1基因突变体是将烟草种子经诱变后造成烟草NtCCC1基因第650位的T突变为A而获得，该突变可显著降低烟草烟叶中氯离子含量。
[0020]2、本专利技术采用EMS诱变的手段，在栽培烟草中直接敲除氯离子转运相关基因创制低氯离子含量烟草品种，通过采用此分子手段敲除烟草中特定的吸收氯离子通道的分子鉴定方法，在降低烟草烟叶氯离子含量中具有良好的应用前景。
附图说明
[0021]本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0022]图1为本专利技术突变体测序结果图；
[0023]图2为本专利技术突变体扩增条带图；
[0024]图3为本专利技术突变体与野生型单株氯离子含量对比示意图。
具体实施方式
[0025]下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0026]随着分子生物学技术的发展，采用分子手段敲除烟草中特定的吸收氯离子的通道是解决烟草烟叶中的氯离子含量高的一种手段；通过采用EMS诱变的手段在栽培烟草中直接敲除氯离子转运相关基因是创制低氯离子含量烟草品种的有效方法。
[0027]实施例1，本专利技术的第一方面，提供了降低烟草烟叶中氯离子含量的烟草 NtCCC1基因突变体的获得，所述烟草NtCCC1基因突变体为Ntccc1
‑
1，与核苷酸序列为SEQ ID No：1所示的野生型烟草基因相比，突变体含有NtCCC1 基因序列的第650位的T突变为A，于是碱基发生从色氨酸到终止突变的变化，形成终止密码子，使该基因提前终止；所述基因突变体
Ntccc1
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0028]烟草野生型烟草植株NtCCC1基因的cDNA序列如下所示：
[0029]ATGGCGTTCTCATTACTTTGTGTTGCTATGCATGATACAGTTGCGTTCACGGGGTTGAGTTCGGAATCTTTCAAGGAG AACTGGGGTCCTGCTTATCAGAGGACTAATAATGCTGGAATTCCAGATCCTAATGGAAAAATATACTGGAATTTCAAT GCATTGGTAGGTCTCTTTTTTCCAGCTGTGACTGGAATCATGGCAGGTTCAAACCGTTCAGCGTCACTAAAGGATACT CAACGTTCGATTCCTGTTGGGACATTAGCAGCAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草NtCCC1基因突变体，其特征在于：所述烟草NtCCC1基因突变体为Ntccc1
‑
1，其为烟草NtCCC1基因第650位的T突变为A，形成终止密码子，使该基因提前终止；所述基因突变体Ntccc1
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.根据权利要求1所述的烟草NtCCC1基因突变体Ntccc1
‑
1的分...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢贺，白戈，张慧，李勇，苏家恩，杨大海，逄涛，邹聪明，费明亮，范志勇，刘家红，徐天养，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：