烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用，旨在解决现有技术中缺磷土壤影响烟草生长的技术问题。本发明专利技术克隆了一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术克隆的烟草NtSPX4

【技术实现步骤摘要】
烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用


[0001]本专利技术涉及烟草磷代谢
，具体涉及一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用。

技术介绍

[0002]磷是烟草生长发育过程中最重要的营养元素之一，参与体内多种代谢过程，缺磷会抑制细胞的分裂和增殖，造成烟株生长缓慢，根系发育不良，推迟成熟期，叶片狭小，叶色暗绿，调制后的叶片缺乏光泽，油分不足，影响主要化学成分的含量及比例，品质低劣。据调查统计，我国约有2/3的土壤缺磷，并且由于土壤对磷的强烈化学固化作用，土壤中可吸收利用的有效磷极度缺乏。
[0003]因此，通过分子手段提高烟草对磷的吸收和利用效率，具有重要的生产意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是提供一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用，以期解决现有技术中缺磷土壤影响烟草生长的技术问题。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术克隆了一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
[0006]植物中含有SPX结构域的蛋白质参与磷酸盐稳态，包括磷转运和对磷缺乏的适应。但目前关于SPX4基因在烟草磷吸收转运中的功能还未见报道。本专利技术首次发现了两个烟草磷吸收负调控基因NtSPX4
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1和NtSPX4
‑
2。
[0007]基于上述两个烟草磷吸收负调控基因NtSPX4
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1和NtSPX4
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2，本专利技术构建了一种烟草磷吸收负调控基因敲除载体，包括位于所述基因36～55 bp处的gRNA靶位点序列；所述序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]本专利技术将上述烟草磷吸收负调控基因敲除载体转化宿主菌，构建了一种由所述的敲除载体构建的重组菌。
[0009]作为本专利技术的优选实施方式，所述重组菌为农杆菌GV3101菌株。
[0010]为改良磷高效烟草品种，本专利技术提供了一种敲除烟草磷吸收负调控基因的方法，包括以下步骤：（1）将所述的敲除载体构建的重组菌侵染烟草叶片；（2）将所述侵染后的叶片转移到分化培养基上进行分化培养和筛选；（3）将所述筛选出的分化芽转至生根培养基上成苗，即成。
[0011]作为本专利技术的优选实施方式，在所述步骤（2）中，所述分化培养基为添加有0.15 mg
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L
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1 NAA，1 mg
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L
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1 6BA和500 mg
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L
‑1噻孢霉素的MS培养基。
[0012]作为本专利技术的优选实施方式，在所述步骤（3）中，所述生根培养基为添加有0.1 mg
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L
‑1NAA和500 mg
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L
‑1噻孢霉素的MS培养基。
[0013]作为本专利技术的优选实施方式，所述MS培养基还添加有6.0～8.0 mg
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‑1潮霉素。
[0014]最后，本专利技术将所述的基因、载体、重组菌或方法在磷低效的烟草品种进行定向改良中应用。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的主要有益技术效果在于：本专利技术克隆的烟草NtSPX4
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1、NtSPX4
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2基因为烟草磷吸收负调控基因，NtSPX4基因敲除可显著提高烟株有效磷含量，促进植株生长发育和物质积累，可利用该基因对磷低效的烟草品种进行定向改良，培育磷高效烟草品种。
附图说明
[0016]图1为NtSPX4
‑ꢀ
CRISPR/Cas 9基因敲除载体结构图。
[0017]图2为NtSPX4
‑
KO株系中NtSPX4基因突变检测结果图。
[0018]图3为不同磷浓度处理对烟苗生长发育和物质积累的影响；图中，A为磷浓度为10 mmol
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‑1的高磷Hoagland溶液中烟苗生长情况；B为磷浓度为1 mmol
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‑1的标准Hoagland溶液中烟苗生长情况；C为磷浓度为0.005 mmol
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‑1的低磷Hoagland溶液中烟苗生长情况；D为不同磷浓度处理对烟苗鲜重测定柱状图。
[0019]图4为不同磷浓度处理下速效磷含量测定柱状图。
具体实施方式
[0020]下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。
[0021]在以下实施例中所涉及的分析软件如无特别说明，均为常规软件；所涉及的方法，如无特别说明，均为常规方法。所设涉及的试剂，如无特别说明，均为常规市售试剂。
[0022]实施例一：烟草中NtSPX4基因的克隆根据水稻中的OsSPX4基因序列为基础，利用Primer Primer 5.0软件设计上下游引物 (F1：ATGAAATTCGGGAAAGAATTTA，R1：CTATTCTGGTGGATGGGAATCC)。以烟草（品种K326）叶片cDNA为模板进行扩增，扩增产物进行测序，获得了两条与水稻OsSPX4基因高度同源的基因序列，其编码的蛋白在N端均具有一个典型的单一的SPX结构域，分别命名为NtSPX4
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1、NtSPX4
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2。NtSPX4
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1的CDS序列如SEQ ID NO.1所示， NtSPX4
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2的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。
[0023]实施例2：NtSPX4基因敲除载体NtSPX4
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CRISPR/Cas 9的构建根据NtSPX4
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1和NtSPX4
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2的CDS序列，在36～55 bp处设计gRNA靶位点序列（Targeting Sequence：AGAAACCCTACCCGAATGGAGGG），并添加BsaI酶切位点。化学合成靶位点序列及其反向互补序列，退火后形成Oligo二聚体，Oligo二聚体与CRISPR/Cas 9载体经BsaI酶切后进行连接，反应体系如下：CRISPR/Cas 9载体2.0 μL，Oligo二聚体1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，无菌水补充至10.0 μL，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中培养，挑选阳性菌斑，提质粒进行测序，获得NtSPX4
‑ꢀ
CRISPR/Cas 9基因敲除载体，载体如图1所示。
[0024]实施例3：NtSPX4基因敲除株系的创制采用冻融法将NtSPX4
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CRISPR/Cas 9基因敲除载体转入农杆菌GV3101菌株，烟草转化采用叶盘转化法，侵染后的叶片转移到含有6.0 mg
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‑1潮霉素的分化培养基（MS培养基+0.15 mg
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。2.一种烟草磷吸收负调控基因敲除载体，其特征在于，包括gRNA靶位点序列；所述序列如SEQ ID NO.3所示。3.一种由权利要求2所述的敲除载体构建的重组菌。4.依据权利要求3所述的敲除载体构建的重组菌，其特征在于，所述重组菌为农杆菌GV3101菌株。5.一种敲除烟草磷吸收负调控基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将权利要求3或4所述的敲除载体构建的重组菌侵染烟草叶片；（2）将所述侵染后的叶片转移到分化培养基上进行分化培养和筛选；（3）将所述筛选出的分化芽转至生根培养基上成苗，即成。6.依据权利要求5所述的敲除烟草磷吸收负调控基因的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，所述分化培养基为添加有0.15 mg
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【专利技术属性】
技术研发人员：余婧，雷波，余世洲，赵会纳，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：