乏氧响应型比率探针合成方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物分析领域，具体涉及了一种乏氧响应型比率探针合成方法及其应用，旨在解决现有的机体活体乏氧成像往往只能够实现定性的乏氧检测，而无法准确可靠的对乏氧程度进行评估的问题。本发明专利技术包括：采用花青素荧光染料Cy5

【技术实现步骤摘要】
乏氧响应型比率探针合成方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物分析领域，具体涉及了一种乏氧响应型比率探针合成方法及其应用。

技术介绍

[0002]由肿瘤细胞快速增殖以及肿瘤血管异形而导致的乏氧微环境是实体瘤中普遍存在的特征。为了适应乏氧微环境，肿瘤细胞中的乏氧诱导因子(hypoxia
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inducible transcription factor,HIF
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1)被激活，进而导致一系列基因表达的改变，这些基因与代谢改变、细胞迁移、转移和治疗抵抗密切相关。因此，乏氧通常被认为是与肿瘤侵袭性和预后不良密切相关的指标之一。因此，定量乏氧成像对于理解实体肿瘤的恶性行为具有重要意义，并有助于指导治疗及预后评估。
[0003]在过去的几十年里，肿瘤乏氧微环境相关的分子特征不断被发现，包括碳酸酐酶IX(CA
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IX)的过表达、活性氧(ROS)的增加、酸性微环境和硝基还原酶(NTR)活性的升高，这些都促进了乏氧特异性成像技术的发展。其中，乏氧响应型探针获得了越来越多的关注，其“开关”功能解决了活体成像中普遍存在的非特异性结合问题，提供了优越的成像对比度。然而，正常组织中靶标分子的低水平表达仍旧会导致探针的非特异性响应。在理想情况下，如果探针响应型信号强度可以直接反映靶标分子的含量，那么可以通过设置阈值的方式来去除正常组织中的背景信号。然而，大多数响应型探针的信号不仅仅与靶标分子含量相关，同时也受到探针本身浓度的影响。在活体成像中，由于探针递送效率和代谢存在较大的个体差异性，成像区域中的探针浓度往往无法准确预测。因此，活体乏氧成像往往只能够实现定性的乏氧检测，而无法准确可靠的对乏氧程度进行评估。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中的上述问题，即现有的机体活体乏氧成像往往只能够实现定性的乏氧检测，而无法准确可靠的对乏氧程度进行评估的问题，本专利技术提供了一种乏氧响应型比率探针合成方法，包括：采用具有内部疏水空腔及表面修饰位点丰富的纳米材料，修饰乏氧响应型荧光基团、内参荧光基团和肿瘤识别基团，获得乏氧响应型比率探针。
[0005]在一些优选的实施方式中，所述内部疏水空腔及表面修饰位点丰富的纳米材料，包括脂质体、二氧化硅微球和树枝状大分子中的一种或多种；
[0006]在一些优选的实施方式中，所述乏氧响应型荧光基团，包括ROS、pH和硝基还原酶响应型荧光分子中的一种或多种。
[0007]在一些优选的实施方式中，所述内参荧光基团，包括Cy5.5，IRDye800，ICG中的一种或多种。
[0008]在一些优选的实施方式中，所述肿瘤识别基团，根据目标肿瘤的不同选取靶向性抗体、多肽或核苷酸中的一种或多种。
[0009]在一些优选的实施方式中，所述乏氧响应型比率探针，其制备方法具体为：
[0010]步骤S100，通过将内参荧光基团选取花青素荧光染料Cy5
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NHS与纳米材料选取第五代聚酰胺
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胺树枝状大分子PAMAMG5的外表面氨基共价结合成为PG5
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Cy5；
[0011]步骤S200，将乏氧响应型荧光基团选取硝基还原酶响应型荧光分子Cy7
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NO2分子包封于PG5
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Cy5的疏水空腔，形成Cy7
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NO2/PG5
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Cy5；
[0012]步骤S300，将肿瘤识别基团选取寡透明质酸LWHA修饰于Cy7
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NO2/PG5
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Cy5外层，合成Cy7
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NO2/PG5
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Cy5@LWHA；
[0013]其中，Cy5
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NHS与PAMAMG5的摩尔比不低于1∶1，Cy7
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NO2与PAMAMG5的摩尔比不低于10∶1，LWHA与PAMAMG5的摩尔比不低于1∶1。
[0014]在一些优选的实施方式中，所述步骤S100，具体为：
[0015]将0.7mg花青素荧光染料Cy5
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NHS溶解于1mL的1∶1的丙酮
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甲醇溶剂中，获得Cy5
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NHS溶液；
[0016]将280mg的PAMAMG5溶解于5mL的pH9.0的硼酸盐缓冲溶液中，获得PG5溶液；
[0017]将所述Cy5
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NHS溶液缓慢滴入所述PG5溶液，并在室温避光搅拌24小时，并将反应物转移到透析袋中透析2天进行去除游离Cy5
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NHS、丙酮和甲醇的操作，冻干获得PG5
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Cy5。
[0018]在一些优选的实施方式中，所述步骤S200，具体为：
[0019]将2mg的硝基还原酶响应型荧光分子Cy7
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NO2溶解于200μL的1∶1的丙酮
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甲醇溶液中，在冰浴中混合2小时，获得Cy7
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NO2溶液；
[0020]将Cy7
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NO2溶液进行5500rpm、4℃超滤操作，直至滤液无吸收峰，获得Cy7
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NO2/PG5
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Cy5溶液。
[0021]在一些优选的实施方式中，所述步骤S300，具体为：
[0022]将6mg的LWHA溶解于2mL的ddH2O，并加入Cy7
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NO2/PG5
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Cy5溶液中，并通过Vortex震荡30秒，4℃静置1小时，得到Cy7
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NO2/PG5
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Cy5@LWHA溶液。
[0023]本专利技术的另一方面，提出了一种采用上述的方法合成的乏氧响应型比率探针在目标细胞中应用；
[0024]通过恒定发光荧光基团对探针浓度进行标定；
[0025]获取乏氧响应型荧光基团与恒定荧光基团信号的比值信号；
[0026]通过所述比值信号消除探针浓度对响应信号的影像，获得与NTR水平线性相关的比值信号，进而完成对乏氧的定量检测，
[0027]本专利技术的有益效果：
[0028](1)通过本申请提出的合成方法制备的乏氧响应型比率探针具有灵敏度高、特异性高、体内长循环的特点，能够在细胞内实现乏氧定量成像，在生物学、医学中具有广阔的应用前景。
附图说明
[0029]通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0030]图1是本专利技术实施例中乏氧响应型比率探针的合成流程示意图；
[0031]图2是本专利技术实施例中乏氧响应型比率探针的吸收光谱；
[0032]图3是本专利技术实施例中乏氧响应型比率探针的荧光光谱；
[0033]图4是本专利技术实施例中乏氧响应型比率探针中恒定发光荧光基团Cy5信号随探针浓度变化曲线；
[0034]图5是本专利技术实施例中乏氧响应型比率探本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，采用具有内部疏水空腔及表面修饰位点丰富的纳米材料，修饰乏氧响应型荧光基团、内参荧光基团和肿瘤识别基团，获得乏氧响应型比率探针。2.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述内部疏水空腔及表面修饰位点丰富的纳米材料，包括脂质体、二氧化硅微球和树枝状大分子中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述乏氧响应型荧光基团，包括ROS、pH和硝基还原酶响应型荧光分子中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述内参荧光基团，包括Cy5.5，IRDye800，ICG中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述肿瘤识别基团，根据目标肿瘤的不同选取靶向性抗体、多肽或核苷酸中的一种或多种。6.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述乏氧响应型比率探针，其制备方法具体为：步骤S100，通过将内参荧光基团选取花青素荧光染料Cy5
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NHS与纳米材料选取第五代聚酰胺
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胺树枝状大分子PAMAMG5的外表面氨基共价结合成为PG5
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Cy5；步骤S200，将乏氧响应型荧光基团选取硝基还原酶响应型荧光分子Cy7
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NO2分子包封于PG5
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Cy5的疏水空腔，形成Cy7
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NO2/PG5
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Cy5；步骤S300，将肿瘤识别基团选取寡透明质酸LWHA修饰于Cy7
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NO2/PG5
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Cy5外层，合成Cy7
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NO2/PP5
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Cy5@LWHA；其中，Cy5
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NHS与PAMAMG5的摩尔比不低于1:1，Cy7
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NO2与PAMAMG5的摩尔比不低于10:1，LWHA与PAMAMG5的摩尔比不低于1:1。7.根据权利要求6所述的乏氧响...

【专利技术属性】
技术研发人员：田捷，冯欣，
申请(专利权)人：中国科学院自动化研究所，
类型：发明
国别省市：