生产麦角硫因的方法技术

本发明专利技术涉及生产麦角硫因的微生物工厂，特别是酵母工厂。还提供了在酵母细胞中生产麦角硫因的方法，以及有用的核酸、多肽、载体和宿主细胞。细胞。细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产麦角硫因的方法


[0001]本专利技术涉及生产麦角硫因(ergothioneine)的微生物工厂，特别是酵母工厂。还提供了在酵母细胞中生产麦角硫因的方法，以及有用的核酸、多肽、载体和宿主细胞。

技术介绍

[0002]麦角硫因(ERG)(2
‑
巯基组氨酸三甲基甜菜碱，(2S)
‑3‑
(2
‑
硫氧代
‑
2,3
‑
二氢
‑
1H
‑
咪唑
‑4‑
基)
‑2‑
(三甲基铵基)丙酸盐)是一种天然存在的抗氧化剂，其可以普遍存在于植物和哺乳动物中；它具有互变异构结构，但在生理pH下主要以硫酮形式存在。麦角硫因显示出抗氧化性质，包括清除自由基和活性氧，以及螯合二价金属离子。已表明麦角硫因减少大鼠和人类的氧化损伤。
[0003]到目前为止，只有一些细菌和真菌被确定为麦角硫因的天然生产者。麦角硫因于1909年在麦角真菌麦角菌(Claviceps purpurea)中被发现，并在两年后确定其结构。后来，发现其他几种生物生产麦角硫因，包括丝状真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、酵母粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和各种放线菌，包括耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。
[0004]人类必须通过其饮食获取麦角硫因；一些蘑菇和其他食物含有高达7mg.g
‑1干重。由于麦角硫因的有益作用以及可能参与预防疾病，麦角硫因已准备好在全球膳食补充剂市场占据一席之地。
[0005]研究表明，人体中的麦角硫因主要积累在肝脏、肾脏、红细胞、骨髓、晶状体和精液中。它由SLC22A4(以前称为OCTN1，大多数动物共有的转运蛋白)转运。体内高丰度的麦角硫因可能表明麦角硫因参与维持健康或减轻疾病。麦角硫因已在多种神经退行性疾病、缺血再灌注损伤和多种其他疾病的体内模型中显示出效果。据报道，麦角硫因可通过SLC22A4/OCTN1的上调在损伤部位积聚。麦角硫因在人体中仅缓慢代谢和排泄，这再次表明它在体内起着重要作用。
[0006]麦角硫因由一分子L
‑
组氨酸、一分子半胱氨酸和通过S
‑
腺苷
‑
L
‑
甲硫氨酸提供的3个甲基合成(图1)。在耻垢分枝杆菌中，反应顺序由5种酶催化，这5种酶由EgtA、EgtB、EgtC、EgtD和EgtE基因编码，这些基因一起位于一个簇中。簇EgtA、EgtB、EgtC和EgtD的四种酶催化4个单独的反应，产生S
‑
(组氨酸三甲基
‑2‑
基)(hercyn
‑2‑
yl)
‑
L
‑
半胱氨酸S
‑
氧化物(HCO)中间体。在真菌中，生物合成途径是不同的，因为单一的酶Egt1催化组氨酸的甲基化产生组氨酸三甲基内盐(hercynine)，组氨酸三甲基内盐又与半胱氨酸硫氧化，产生HCO。HCO被β
‑
裂解酶转化为2
‑
(羟基硫烷基)组氨酸三甲基内盐(2
‑
(hydroxysulfanyl)hercynine)，β
‑
裂解酶由耻垢分枝杆菌中的EgtE和真菌中的Egt2基因编码。该化合物显然会自发地还原为麦角硫因。
[0007]目前生产麦角硫因的方法主要基于化学合成。此类方法不符合成本效益，而且对环境也有重大影响。因此，需要具有成本效益和环境友好的麦角硫因生产方法。
[0008]专利技术概述
[0009]本专利技术提供了能够生产麦角硫因的酵母细胞和在酵母细胞中生产麦角硫因的方法。
[0010]一方面，提供了一种能够产生麦角硫因的酵母细胞，所述酵母细胞表达：
[0011]a)至少一种能够将L
‑
组氨酸和/或L
‑
半胱氨酸转化为S
‑
(组氨酸三甲基
‑2‑
基)
‑
L
‑
半胱氨酸
‑
S
‑
氧化物的第一异源酶；和
[0012]b)至少一种能够将S
‑
(组氨酸三甲基
‑2‑
基)
‑
L
‑
半胱氨酸
‑
S
‑
氧化物转化为2
‑
(羟基硫烷基)
‑
组氨酸三甲基内盐的第二异源酶；
[0013]其中酵母细胞还能够将2
‑
(羟基硫烷基)
‑
组氨酸三甲基内盐转化为麦角硫因。
[0014]本专利技术还提供了在酵母细胞中生产麦角硫因的方法，包括以下步骤：
[0015]i)提供能够产生麦角硫因的酵母细胞，所述酵母细胞表达：
[0016]a)至少一种能够将L
‑
组氨酸和/或L
‑
半胱氨酸转化为S
‑
(组氨酸三甲基
‑2‑
基)
‑
L
‑
半胱氨酸
‑
S
‑
氧化物的第一异源酶；和
[0017]b)至少一种能够将S
‑
(组氨酸三甲基
‑2‑
基)
‑
L
‑
半胱氨酸
‑
S
‑
氧化物转化为2
‑
(羟基硫烷基)
‑
组氨酸三甲基内盐的第二异源酶；
[0018]其中酵母细胞还能够将2
‑
(羟基硫烷基)
‑
组氨酸三甲基内盐转化为麦角硫因；
[0019]ii)在培养基中培养所述酵母细胞；
[0020]从而获得麦角硫因。
[0021]本文还提供了：
[0022]·
具有如SEQ ID NO:6(CpEgtl)所示序列的多肽或其与SEQ ID NO:6具有至少70％的同源性的功能变体，其与SEQ ID NO:6具有至少70％同源性的同源物，例如与SEQ ID NO:6具有至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性；
[0023]·
具有如SEQ ID NO:12(CpEgt2)所示序列的多肽或其功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种能够生产麦角硫因的酵母细胞，所述酵母细胞表达：a)至少一种能够将L
‑
组氨酸和/或L
‑
半胱氨酸转化为S
‑
(组氨酸三甲基
‑2‑
基)
‑
L
‑
半胱氨酸
‑
S
‑
氧化物的第一异源酶；和b)至少一种能够将S
‑
(组氨酸三甲基
‑2‑
基)
‑
L
‑
半胱氨酸
‑
S
‑
氧化物转化为2
‑
(羟基硫烷基)
‑
组氨酸三甲基内盐的第二异源酶；其中所述酵母细胞进一步能够将2
‑
(羟基硫烷基)
‑
组氨酸三甲基内盐转化为麦角硫因。2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中，所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofera)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、出芽丝孢酵母(Trichosporon pullulan)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，优选地，所述酵母是酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母或解脂耶氏酵母。3.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述第一异源酶和第二异源酶是：i)NcEgt1和CpEgt2；ii)NcEgt1和SpEgt2；iii)NcEgt1和NcEgt2；iv)NcEgt1和MsEgtE；v)SpEgt1和NcEgt2；vi)SpEgt1和SpEgt2；vii)SpEgt1和CpEgt2；viii)SpEgt1和MsEgtE；ix)CpEgt1和NcEgt2；x)CpEgt1和SpEgt2；xi)CpEgt1和CpEgt2；xii)CpEgt1和MsEgtE，或其功能变体，所述功能变体具有与所述第一异源酶和第二异源酶至少70％的同源性，例如具有与所述第一异源酶和第二异源酶至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性。4.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述第一异源酶和第二异源酶是：
i)NcEgt1和CpEgt2；ii)NcEgt1和SpEgt2；iii)NcEgt1和NcEgt2；iv)NcEgt1和MsEgtE；xii)CpEgt1和MsEgtE，或其功能变体，所述功能变体具有与所述第一异源酶和第二异源酶至少70％的同源性，例如具有与所述第一异源酶和第二异源酶至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同源性。5.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞进一步表达或过表达麦角硫因转运蛋白，任选地，异源麦角硫因转运蛋白，例如MsErgT(SEQ ID NO:35)或HsSLC22A4(SEQ ID NO:36)，或其变体，所述变体具有与MsErgT或HsSLC22A4至少70％的同源性，例如具有与MsErgT或HsSLC22A4至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％...

【专利技术属性】
技术研发人员：I，
申请(专利权)人：丹麦科技大学，
类型：发明
国别省市：