一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法，涉及微生物检测领域。包括以下步骤：1)样品前处理：将凝结芽孢杆菌样品经超声处理、摇床震荡制得菌液；2)活菌数检测：将菌液和检测培养基混合均匀，倒入水琼脂平板,形成双层平板，恒温培养，进行活菌计数，检测培养基包括蛋白胨、抗菌肽、山梨醇、麦芽糖、萘磺酸盐甲醛缩合物和轻质碳酸钙。本申请结合益生菌活菌检测的基础方法，针对检测培养基的成分、样品的前处理条件、双平板的培养方式进行全面优化，有效避免低溶度凝结芽孢杆菌受杂菌污染，为凝结芽孢杆菌提供有力的生长环境，检测步骤简单，具备计数结果平行性好、重现性好、培养周期短、精准定量且受人为因素影响小等特点。精准定量且受人为因素影响小等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测领域，尤其涉及一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法。

技术介绍

[0002]凝结芽孢杆菌作为替代抗生素的一种益生菌，目前已广泛使用，它以能产有机酸、抗逆性强、抑制病原菌等优点脱颖而出，并且它也是替代乳酸菌的优秀产品，有效的避免了乳酸菌的抗逆性差，保存期短等缺点。凝结芽孢杆菌具有耐受高温、高压，同时对胃酸和胆汁有较高的耐受性，所以它是集乳酸菌与芽孢杆菌优点于一身，因此也是畜牧行业研究的重点。
[0003]益生菌的活菌数是目前评价产品质量的指标之一，理想的活菌计数方法应具备计数结果平行性好、重现性好等特点，但是，由于凝结芽孢杆菌多数是通过液体深层发酵，经喷雾干燥得来干粉，因在发酵过程中存在糖类及小肽等多种培养基及代谢产物，经高温喷雾干燥后，凝结芽孢杆菌与其吸附交联在一起，这就造成了菌体密度过高，菌体之间紧密结合在一起，形成生物膜而不易分离，从而使用现有益生菌活菌计数方法，检测时因处理的方式不同，导致凝结芽孢杆菌活菌数检测差异很大。另外由于凝结芽孢杆菌属于兼性厌氧菌，生长速度不如其他芽孢杆菌快，所以低浓度凝结芽孢杆菌很容易被其他芽孢杆菌污染，从而导致凝结芽孢杆菌无法检出。
[0004]因此，急需研制出针对凝结芽孢杆菌进行的精准定量且重现性好的活菌数检测方案。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法，以解决目前凝结芽孢杆菌活菌数检测重现性、精准性差的技术问题。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术目的提供了一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法，包括以下步骤：
[0007]1)样品前处理：将凝结芽孢杆菌颗粒或粗样品加入到无菌生理盐水中，超声处理，加入吐温80和灭菌后的玻璃珠，摇床震荡，稀释后制得菌液；
[0008]2)活菌数检测：将菌液和检测培养基混合均匀，然后倒入水琼脂平板,静置待凝固，形成双层平板，将双层平板恒温培养，进行活菌计数；
[0009]其中，所述检测培养基包括以下重量份原料：蛋白胨8份
‑
12份、抗菌肽0.05份
‑
0.2份、山梨醇1份
‑
5份、麦芽糖10份
‑
30份、萘磺酸盐甲醛缩合物0.5份
‑
1.5份和轻质碳酸钙0.5份
‑
2份。
[0010]通过采用上述方案，本申请结合益生菌活菌检测的基础方法，针对凝结芽孢杆菌样品检测培养基的成分、样品的前处理条件、双平板的培养方式等进行全面优化，低浓度的抗菌肽可以有效防止杂菌的污染，并且对凝结芽孢杆菌没有伤害，有效避免较低溶度的凝结芽孢杆菌受杂菌污染，麦芽糖和山梨醇作为碳源，两种碳源对凝结芽孢杆菌有很好促生
长作用，萘磺酸盐甲醛缩合物可以更好的打散疏水颗粒，让凝结芽孢杆菌更好的释放，轻质碳酸钙能够中和凝结芽孢杆菌生长过程中产生的有机酸，从而平衡培养基的pH值，为凝结芽孢杆菌提供有力的生长环境，该方法检测步骤简单，具备计数结果平行性好、重现性好、培养周期短、精准定量且受人为因素影响小等特点。
[0011]作为优选方案，所述检测培养基还包括以下重量份原料：牛肉膏3份
‑
15份、酵母粉2份
‑
10份、三水合磷酸氢二钾0.1份
‑
0.5份、七水合硫酸镁0.2份
‑
1份、四水合硫酸锰0.05份
‑
0.5份和琼脂粉8份
‑
10份。
[0012]作为优选方案，所述抗菌肽的分子量为1000
‑
4000。
[0013]作为优选方案，在步骤2)中，所述菌液和检测培养基的体积比为1：15。
[0014]作为优选方案，所述检测培养基为半固体培养基。
[0015]通常采用上述方案，检测培养基近似半固体培养基，有利于凝结芽孢杆菌生长的辨别，因凝结芽孢杆菌属于兼性厌氧菌，同时更有利于菌体的厌氧生长。
[0016]作为优选方案，所述检测培养基的PH为7.0
‑
7.2。
[0017]作为优选方案，所述检测培养基的制备方法为：
[0018]S101、称取所需量蛋白胨、山梨醇、牛肉膏、酵母粉、麦芽糖，加蒸馏水溶解，制得盐溶液A；
[0019]S102、称取所需量三水合磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、四水合硫酸锰，加蒸馏水溶解，制得盐溶液B；
[0020]S103、将盐溶液A加入到盐溶液B中，充分搅拌均匀，再加入所需的琼脂粉，加热溶解琼脂粉，然后加入所需量的轻质碳酸钙，蒸馏水定容到所需量，灭菌制得无菌培养基；
[0021]S104、抗菌肽和萘磺酸盐甲醛缩合物按所需量分别用蒸馏水溶解，无菌过滤，制得无菌混溶液；
[0022]S105、将无菌混溶液加入无菌培养基中，混合均匀，保温备用。
[0023]作为优选方案，所述水琼脂平板包括2wt％琼脂粉和余量的水。
[0024]作为优选方案，在步骤1)中，所述超声处理的功率为240W
‑
480W，超声时间为5min
‑
8min，所述摇床震荡时间为20min
‑
40min。
[0025]作为优选方案，在步骤2)中，恒温培养的温度为37℃
‑
50℃，时间为24h
‑
48h。
[0026]通过采用上述方案，对检测阶段的培养温度、超声、震荡时间参数进行优化控制，该凝结芽孢杆菌活菌数的检测重现性较好，检测结果精准。
[0027]相比于现有技术，本专利技术实施例具有如下有益效果：
[0028]本申请结合益生菌活菌检测的基础方法，针对凝结芽孢杆菌样品检测培养基的成分、样品的前处理条件、双平板的培养方式等进行全面优化，低浓度的抗菌肽可以有效防止杂菌的污染，有效避免较低溶度的凝结芽孢杆菌受杂菌污染，为凝结芽孢杆菌提供有力的生长环境，该方法检测步骤简单，具备计数结果平行性好、重现性好、培养周期短、精准定量且受人为因素影响小等特点。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的
实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]鉴于目前凝结芽孢杆菌检测存在的问题，本申请研究出特有的凝结芽孢杆菌检测方法，特有的前处理方式，结合益生菌活菌检测的基础方法，针对凝结芽孢杆菌样品检测培养基成分、前处理条件、培养方式等进行全面优化，提供了一种特有的凝结芽孢杆菌产品中活菌数检测的方法，该方法具备计数结果平行性好、重现性好、精准定量且受人为因素影响小等特点，显著提高凝结芽孢杆菌活菌检测合格率。
[0031]本申请提供一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法，包括以下步骤：S1、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)样品前处理：将凝结芽孢杆菌颗粒或粗样品加入到无菌生理盐水中，超声处理，加入吐温80和灭菌后的玻璃珠，摇床震荡，稀释后制得菌液；2)活菌数检测：将菌液和检测培养基混合均匀，然后倒入水琼脂平板,静置待凝固，形成双层平板，将双层平板恒温培养，进行活菌计数；其中，所述检测培养基包括以下重量份原料：蛋白胨8份
‑
12份、抗菌肽0.05份
‑
0.2份、山梨醇1份
‑
5份、麦芽糖10份
‑
30份、萘磺酸盐甲醛缩合物0.5份
‑
1.5份和轻质碳酸钙0.5份
‑
2份。2.如权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法，其特征在于，所述检测培养基还包括以下重量份原料：牛肉膏3份
‑
15份、酵母粉2份
‑
10份、三水合磷酸氢二钾0.1份
‑
0.5份、七水合硫酸镁0.2份
‑
1份、四水合硫酸锰0.05份
‑
0.5份和琼脂粉8份
‑
10份。3.如权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法，其特征在于，所述抗菌肽的分子量为1000
‑
4000。4.如权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述菌液和检测培养基的体积比为1：15。5.如权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄明媛，倪冬姣，邹新华，许赣荣，宋敏，李红胜，邢宏博，宋汉良，赵骏，卢秋咏，
申请(专利权)人：佛山播恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：