基于拉曼光谱对被调控细胞的局域生化环境的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于拉曼光谱对被调控细胞的局域生化环境的检测方法，将金纳米棒溶液滴加在微纳结构表面，使得金纳米棒在该微纳结构中的自组装，得到用于单细胞调控和检测一体化的模板；对模板的金纳米棒组装进行修饰；将修饰后的模板作为细胞生长的基底，将贴壁细胞播种在该基底上，从而得到细胞形貌和生长方向特定的单细胞；检测所得单细胞的拉曼光谱获得局域生化微环境的数据，检测被测细胞的拉曼光谱时，将入射激光的光斑对准特定的单细胞或者单细胞的特定部位。本发明专利技术检测方法将细胞生长调控与细胞局域部位检测进行集成，实现了高通量，高灵敏度和对样品低损伤的一体化单细胞检测，对于在线实时揭示细胞调控的内在生理变化有重要意义。化有重要意义。化有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
基于拉曼光谱对被调控细胞的局域生化环境的检测方法


[0001]本专利技术涉及一种检测被调控细胞的方法，尤其涉及一种结合有自组装金纳米棒的微纳结构，并通过该微纳结构对细胞的生长进行调控，同时对被调控细胞特定位点进行拉曼检测的方法。

技术介绍

[0002]不同形貌的微纳结构会对细胞的行为和状态产生影响。例如，细胞更有可能粘附生长于更为粗糙的微纳结构表面，而微纳米尺度的各向异性结构特征可以使细胞定向生长，改变细胞的骨架结构并诱导细胞分化。通过微纳结构调控细胞的生长和行为在组织工程和临床应用中具有重要的作用，随着微纳米制造技术的发展，基于微纳结构调控细胞已逐渐成为热门领域之一。而在细胞被调控过程中，其周围的生化微环境会发生改变，通过检测细胞局域生化环境，如pH值，可以实现对细胞功能的探究和对细胞命运的预测。例如，肿瘤细胞的胞外pH值低于正常细胞，较低的pH值有利于细胞的迁移和入侵行为。但是，通常对于被调控细胞的局域生化微环境的变化缺乏深入研究。
[0003]通常检测被调控细胞的手段是利用显微镜成像观察细胞外在形貌的改变，或利用荧光标记特定的蛋白质等生物分子进行荧光成像，或者利用微针等刺破细胞以提取出其内部成分。这些方法在定量检测被调控细胞的局域生化环境时存在许多局限性，例如由于荧光光谱较宽容易产生光谱的重叠现象，导致难以区分其荧光光谱重叠的两种分子，而且光漂白、光淬灭等现象也影响了基于荧光强度进行定量检测的准确性，同时由于许多荧光物质难以标记活细胞，利用荧光染色时需要将细胞固定，导致荧光强度表征不利于实时动态检测活细胞的局域生化微环境。而刺破细胞提取其内部成分等方法对细胞的破坏性大，不仅难以实现细胞实时动态检测，而且在细胞受损时其局域生化环境可能会由于应激反应发生改变，影响了测量的准确性。因此，虽然已有许多文献报道了基于微纳结构实现的细胞调控，但是这些微纳结构调控细胞后却难以实现对于这些被调控细胞局域生化微环境的实时动态检测。
[0004]为了实现对被调控单细胞局域生化微环境的实时动态检测，一种对细胞无损、便于操作且具有高灵敏度的检测方法尤为重要。基于拉曼光谱的检测方法对样品的损伤小、所需样本量少还可以提供丰富的化学成分信息，但是其信号弱、检测灵敏度低则限制了拉曼检测的应用。然而，当激光照射到粗糙的金属表面上时，由于局域电磁场的增强和电荷转移等现象的产生，拉曼散射信号被增强上万甚至亿倍，实现了表面增强拉曼散射，极大地提高了拉曼检测的灵敏度和信噪比。由于细胞内外的成分复杂而且含量较低，故灵敏度高、对样品破坏小、所含信息丰富的表面增强拉曼散射成为了实现活细胞检测的有效手段。
[0005]为了获得具有高灵敏度、高可重复性的表面增强拉曼散射基底，即具有均一结构的粗糙金属表面，通常有自上而下法和自下而上法。自上而下法是指通过去除部分材料使较大尺寸减少到所需尺寸来获得微纳结构，包括光刻、湿法刻蚀、电子束刻蚀和纳米压印刻蚀等。自上而下法有利于在微米尺度上形成有序图案，但在构建纳米尺度或任意三维结构
方面存在困难。自下而上法是指将分子或原子成分组装成微纳米结构，如自组装、化学气相沉积和原子层沉积等。其中，自组装法由于不需要复杂的工艺流程和昂贵的设备，而且对于原材料的耗费较低，具有成本效益，受到了广泛的关注。为了实现金纳米棒的自组装，常用的方法有溶剂蒸发自组装、有机溶剂辅助自组装、模板辅助自组装等。由于基底、空气、水三相界面处的溶剂蒸发速度相对液滴中心更快，金纳米棒的浓度更高，故溶剂蒸发法获得的金纳米棒自组装具有咖啡环效应，限制了其作为细胞培养与拉曼检测基底的均一性和可重复性。通过控制溶剂蒸发时的条件，如温度、湿度、基底的亲疏水性等，降低溶剂蒸发速度，使液滴不同位置的金纳米棒浓度保持相近，可改善组装效果。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术，本专利技术提出一种基于拉曼光谱对被调控细胞的局域生化环境的检测方法，实现了高通量，高灵敏度和对样品低损伤的一体化单细胞检测，对于在线实时揭示细胞调控的内在生理变化有重要意义。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提出的一种基于拉曼光谱对被调控细胞的局域生化环境的检测方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1)将金纳米棒溶液滴加在微纳结构表面，通过控制溶剂蒸发时的温度和湿度条件，使得金纳米棒在该微纳结构中的自组装，制备得到用于单细胞调控和检测一体化的模板；
[0009]步骤2)根据检测的指标不同，对所述模板的金纳米棒组装进行修饰，得到修饰后的模板，包括在所述的金纳米棒组装上修饰下述有机物中的一种：
[0010]a)在金纳米棒组装上修饰4
‑
巯基吡啶，用于进行单细胞局域pH检测或是单细胞特定部位pH检测；
[0011]b)在金纳米棒组装上修饰1
‑
硫代癸烷，用于进行单细胞葡萄糖的检测；
[0012]c)在金纳米棒组装上修饰多巴胺适配体，用于进行单细胞多巴胺的检测；
[0013]d)在金纳米棒组装上修饰DNA单链，用于与DNA单链碱基配对的RNA检测；
[0014]步骤3)将步骤2)得到的修饰后的模板作为细胞生长的基底，将贴壁细胞播种在该基底上，利用金纳米棒的亲水性，使细胞特异生长在微纳结构上，通过基底表面的形貌结构对贴壁细胞的生长进行调控，从而得到细胞形貌和生长方向特定的单细胞；
[0015]步骤4)检测步骤3)所得单细胞的拉曼光谱获得局域生化微环境的数据，检测被测细胞的拉曼光谱时，将入射激光的光斑对准特定的单细胞或者单细胞的特定部位。
[0016]进一步讲，本专利技术所述的基于拉曼光谱对被调控细胞的局域生化环境的检测方法，步骤1)中，所述的微纳结构的制备包括下述方法之一：
[0017]a)通过光刻获得的具有微米级结构的硅模板；
[0018]b)通过光刻获得具有微米级结构的硅模板；然后通过聚二甲基硅氧烷(PDMS)对所述硅模板进行倒模后获得的柔性模板；
[0019]c)首先通过光刻获得具有微米级结构的硅模板；然后通过聚二甲基硅氧烷(PDMS)对所述硅模板进行倒模获得柔性模板；随后将所述柔性模板与一载玻片的表面贴合，使得聚二甲基硅氧烷与玻璃键合，剥离柔性模板后，所述载玻片表面残留纳米级厚度的聚二甲基硅氧烷结构，获得亲疏水相间的微纳结构。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0021]本专利技术将细胞生长调控与细胞局域部位检测进行集成，实现了高通量，高灵敏度和对样品低损伤的一体化单细胞检测。本专利技术首先通过构建界面微纳结构实现了金纳米棒的可控自组装，并使细胞特异性结合于金纳米棒表面，利用微纳结构实现了对细胞定向生长的调控。随后利用金纳米棒定向组装的表面增强拉曼散射(SERS)效应，实现了细胞调控与在线检测的一体化。同时发现细胞的拉曼光谱中包含反映pH值变化的特征峰，由此通过所制备的平台实现了对被调控单细胞特定位置的pH值的检测。本专利技术对于在线实时揭示细胞调控的内在生理变化有重要意义。
附图说明
[0022]图1是本专利技术中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于拉曼光谱对被调控细胞的局域生化环境的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1)将金纳米棒溶液滴加在微纳结构表面，通过控制溶剂蒸发时的温度和湿度条件，使得金纳米棒在该微纳结构中的自组装，制备得到用于单细胞调控和检测一体化的模板；步骤2)根据检测的指标不同，对所述模板的金纳米棒组装进行修饰，得到修饰后的模板，包括在所述的金纳米棒组装上修饰下述有机物中的一种：a)在金纳米棒组装上修饰4
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巯基吡啶，用于进行单细胞局域pH检测或是单细胞特定部位pH检测；b)在金纳米棒组装上修饰1
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硫代癸烷，用于进行单细胞葡萄糖的检测；c)在金纳米棒组装上修饰多巴胺适配体，用于进行单细胞多巴胺的检测；d)在金纳米棒组装上修饰DNA单链，用于与DNA单链碱基配对的RNA检测；步骤3)将步骤2)得到的修饰后的模板作为细胞生长的基底，将贴壁细胞播种在该基底上，利用金纳米棒的亲水性，使细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳艳，吴晓宇，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：