本发明专利技术提供一种用于核酸检测的微流控芯片及检测方法。所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为气道层、中间层和流道层；所述气道层包含两个独立的气道，所述中间层为弹性薄膜，用于控制流道层上微阀的开启和关闭，所述流道层包含四个进样口，两个出样口，四个微阀，一个LAMP反应室、一个CRISPR反应室以及若干条流道，所述微阀通过弹性薄膜与气道层的气道相连，并通过气道层气压的改变来实现微阀的开关，实现不同进样口的顺序进样。本发明专利技术将微流控与LAMP扩增技术以及CRISPR检测技术相结合，在单个芯片上实现高灵敏，高特异性的检测病毒核酸。高特异性的检测病毒核酸。高特异性的检测病毒核酸。
【技术实现步骤摘要】
用于核酸检测的微流控芯片及检测方法
[0001]本专利技术涉及分子检测
，具体地说，涉及一种用于核酸检测的微流控芯片及检测方法。
技术介绍
[0002]新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID
‑
19）是一种急性呼吸道传染病，患者以发热、干咳、乏力等为主要表现，可导致急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。目前迫切需要一种快速、方便和准确的方法来检测新冠病毒。
[0003]定量逆转录聚合酶链反应被认为是“金标准”，常被用于新冠病毒的核酸检测，但是这种方法需要专业的人员和专门的设备，不仅速度慢且不适合床旁诊断。成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 相关(Cas) 核酸酶方法目前已被应用于病原体检测，这种方法速度快、特异性高且操作简单。CRISPR/Cas12a系统用于核酸检测的原理是：Cas12a酶与相应的crRNA结合成Cas12a
‑
crRNA复合体，一旦crRNA识别到对应的靶标，Cas12a酶就会被激活，随后无差别的切割附近的单链DNA。基于该原理，将单链DNA制备成淬灭的荧光探针，通过监测荧光信号可实现目标序列的检测。LAMP扩增具有高度特异性，可在短时间内产生高产量的扩增子，扩增子与CRISPR
‑
Cas系统结合，可实现对目标核酸的几个拷贝的高度特异性、灵敏的检测。
[0004]微流控芯片技术是1990年由Manz等人首次提出，它凭借体积小、试剂使用量小、反应快、易携带、可并行处理和易实现自动化等优势，在生物、化学和医药领域得到了广泛的应用。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种用于核酸检测的微流控芯片及检测方法，特别是基于CRISPR/Cas系统，结合LAMP扩增技术，提供一种可以快速检测新型冠状病毒的高灵敏、高特异性的核酸检测芯片。
[0006]所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为气道层、中间层和流道层；所述气道层包含两个独立的气道，分别为气道I、气道II；其中，气道I呈1字形，与流道层上微阀
④
的位置相对应；气道II呈T字形，T字形的一边与流道层上微阀
①
和微阀
②
的位置相对应；T字形的另一边与流道层上微阀
③
的位置相对应；气道I的两端分别设有进气口和出气口，气道II包含三个端口，其中一个端口为封闭状态，另两个端口分别为进气口和出气口；且两个气道的端口不重合；所述中间层为弹性薄膜，用于控制流道层上微阀的开启和关闭（通过改变气道中的气压以实现微阀的开闭）；所述流道层包含四个进样口，两个出样口，四个微阀，一个LAMP反应室、一个
CRISPR反应室以及若干条流道；其中，所述流道层由左至右分别为丫字形流道、LAMP反应室和CRISPR反应室，两个反应室之间通过流道
①
连通，丫字形流道的一端与LAMP反应室连通，另两端的端口分别为两个进样口；流道
①
包含一条与流道
①
呈T字交叉垂直设置的分支流道
②
，分支流道
②
的末端为进样口；丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有一条分支流道
③
，分支流道
③
的末端为进样口；且分支流道
③
与分支流道
②
平行排布；分支流道
②
上设有微阀
①
，分支流道
③
上设有微阀
②
，且微阀
①
与微阀
②
之间的连线与流道
①
平行；流道
①
上设有微阀
③
，且微阀
③
位于LAMP反应室与流道
①
的分支点之间；丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有微阀
④
，且微阀
④
位于丫字形流道的分叉点与丫字形流道的分支点之间；微阀
④
通过弹性薄膜与气道层的气道I相连；微阀
①
、
②
和
③
通过弹性薄膜与气道层的气道II相连；LAMP反应室和CRISPR反应室上各设有一个出样口，或者出样口位于反应室外侧并通过流道分别与各反应室连通。
[0007]优选地，用于制作气道层、流道层的材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS）。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种核酸检测方法（含非疾病诊断和治疗目的），利用所述微流控芯片进行核酸检测。
[0009]具体地，所述核酸检测方法包括以下步骤：（1）向微流控芯片的气道II中通入气体，使得微阀
④
打开，微阀
①
、
②
、
③
关闭；（2）向微流控芯片的丫字形流道的一个进样口中通入待测液体样本，另一个进样口中通入LAMP扩增反应液，两种液体流向LAMP反应室；（3）将微流控芯片置于60
‑
65℃（优选63℃左右）保温30~60分钟，得到LAMP反应产物；（4）向微流控芯片的气道I中通入气体，使得微阀
④
关闭，微阀
①
、
②
、
③
打开；（5）向微流控芯片的分支流道
③
的进样口中通入双蒸水或缓冲液，使LAMP反应产物进入CRISPR反应室，同时向分支流道
②
的进样口中通入CRISPR反应液，流向CRISPR反应室；（6）将微流控芯片置于37℃左右保持5~10分钟，分析所得的反应产物。
[0010]前述的方法，所述CRISPR反应液包含反应缓冲液、Cas12a蛋白、RNase 抑制剂 、crRNA和ssDNA，其中ssDNA为淬灭的荧光探针。
[0011]所述LAMP扩增反应液包含LAMP Master预混液，一对外部引物（F3和B3）、一对内部引物（FIP和BIP）以及两个环导引物（loop F和loop B）。
[0012]进一步地，步骤（6）将所述微流控芯片置于荧光检测平台，通过检测荧光信号来检测样本中的核酸。
[0013]本专利技术中，样本可以是病毒的DNA或RNA。
[0014]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：（一）本专利技术将微流控与LAMP扩增技术以及CRISPR检测技术相结合，在单个芯片上
实现高灵敏，高特异性的检测病毒核酸。
[0015]（二）采用封闭式的方式，全程无污染。
[0016]（三）实现COVID
‑
19等冠状病毒的核酸检测，实现对病毒感染的快速应对。
附图说明
[0017]图1为本专利技术较佳实施例中微流控芯片的整体结构示意图。
[0018]图2为图1中气道层的结构示意图。
[0019本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于核酸检测的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为气道层、中间层和流道层；所述气道层包含两个独立的气道，分别为气道I、气道II；其中，气道I呈1字形，与流道层上微阀
④
的位置相对应；气道II呈T字形，T字形的一边与流道层上微阀
①
和微阀
②
的位置相对应；T字形的另一边与流道层上微阀
③
的位置相对应；气道I的两端分别设有进气口和出气口，气道II包含三个端口，其中一个端口为封闭状态，另两个端口分别为进气口和出气口；且两个气道的端口不重合；所述中间层为弹性薄膜，用于控制流道层上微阀的开启和关闭；所述流道层包含四个进样口，两个出样口，四个微阀，一个LAMP反应室、一个CRISPR反应室以及若干条流道；其中，所述流道层由左至右分别为丫字形流道、LAMP反应室和CRISPR反应室，两个反应室之间通过流道
①
连通，丫字形流道的一端与LAMP反应室连通，另两端的端口分别为两个进样口；流道
①
包含一条与流道
①
呈T字交叉垂直设置的分支流道
②
，分支流道
②
的末端为进样口；丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有一条分支流道
③
，分支流道
③
的末端为进样口；且分支流道
③
与分支流道
②
平行排布；分支流道
②
上设有微阀
①
，分支流道
③
上设有微阀
②
，且微阀
①
与微阀
②
之间的连线与流道
①
平行；流道
①
上设有微阀
③
，且微阀
③
位于LAMP反应室与流道
①
的分支点之间；丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有微阀
④
，且微阀
④
位于丫字形流道的分叉点与丫字形流道的分支点之间；微阀
④
...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文，陈瑞，唐仕川，周兴藩，王煜倩，常宇清，魏泽文，
申请(专利权)人：北京市科学技术研究院城市安全与环境科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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