检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的试剂组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的试剂组合物及其应用。具体提供一种用于流式细胞术检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的试剂组合物，包括第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体，第一组抗体包括抗CD99抗体、抗CD1a抗体、抗CD34抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD8抗体、抗CD7抗体、抗CD45抗体、抗CD2抗体；第二组抗体包括抗CD3抗体、抗CD7抗体、抗CD16抗体、抗CD56抗体、抗CD45抗体；第三组抗体包括抗胞核TdT抗体、抗胞浆CD3抗体。本发明专利技术的试剂组合物可用于流式细胞术检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病，降低漏诊概率，还可同时进行免疫评价。还可同时进行免疫评价。

【技术实现步骤摘要】
检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的试剂组合物及其应用


[0001]本专利技术是关于一种检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的试剂组合物及其应用。

技术介绍

[0002]长期以来，急性白血病始终是因为恶性度高、疾病进展快、复发率高、死亡率高而成为严重影响人类健康的疾病，急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukaemia，ALL）约占急性白血病的30%
‑
40%，其中急性T淋巴细胞白血病（T
‑
ALL）是当前治疗效果较差的一种急性白血病，治疗后效果评价尤为重要。
[0003]目前流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测微小残留病（Minimal Residue Disease，MRD），是各种急性白血病治疗后效果评价的重要手段。多项研究也表明，不论在化疗后的哪个时间点，移植前后、CAR
‑
T前后、CAR
‑
T桥接移植前后，FCM检测MRD都对预后判断和指导治疗具有重要意义。然而，尽管流式细胞术长期以来技术进展快，但是临床应用规模难以扩大，主要原因在于从标本处理到数据分析全程手工操作，缺乏规范化和自动化、智能化，严重制约了这项技术的普及。
[0004]T
‑
ALL的MRD是FCM检测MRD中最早开展的项目，T
‑
ALL与急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）和B
‑
ALL不同，T细胞不是在骨髓中发育成熟，因此在骨髓中见到幼稚T细胞即高度可疑为恶性。但是，近年来研究发现，T
‑
ALL的MRD检测并非理论上那样简单，有以下原因严重制约了FCM的MRD检测：
①
早期标志物丢失率高：T
‑
ALL治疗后随访，抗原漂移率很高，尤其是初治时覆盖率较高的早期标志（如CD99强表达和TdT），初治时表达率70%
‑
95%，但是随着治疗这些标志的表达强度会减弱或者丢失，甚至标志cCD3都会丢失，给高灵敏度的MRD检测带来极大的难度；
②
成熟标志的获得：T
‑
ALL往往随着治疗，表型越来越成熟，不仅表现在早期标志的丢失，还表现在将可能获得一些成熟标志，而现有技术的检测方案并没有对成熟标志进行系统研究，存在很高比例的病例漏诊；
③
成熟淋巴细胞的免疫表型多样性：虽然理论上成熟T细胞分为CD4+和CD8+细胞群，但是由于病毒感染和个体差异等原因，会造成有些非肿瘤患者或者非T
‑
ALL的其他肿瘤患者出现CD4+/CD8+或者CD4
‑
/CD8
‑
T细胞（主要是γδT细胞）比例升高，这些都严重干扰T
‑
ALL的MRD检测；
④
T
‑
ALL的表型异质性：T
‑
ALL表型一致性不强，表型多样性造成分析时候的难度加大；
⑤
现有绝大多数T
‑
ALL MRD设门都是采用CD7设置T细胞门，然而，近年来CAR
‑
T技术治疗T
‑
ALL的成功案例基本上集中在基因技术敲除CAR
‑
T细胞上CD7表达的CD7
‑
CAR
‑
T，这样治疗后的病例基本上在2
‑
3个月时间里，正常和恶性细胞均很高概率丢失CD7，这样就给T
‑
ALL的MRD检测带来挑战。
⑥
由于骨髓中没有幼稚T细胞，所以T
‑
ALL的MRD分析时无法象B
‑
ALL的panel一样将B细胞分成3~4个不同阶段细胞来看。并且，T
‑
ALL的MRD分析还存在NK细胞的干扰。
[0005]综上所述，T
‑
ALL的检测难度更大，主观性更强，因此急需一种相对标准化、规范化、覆盖率高，并且受CD7
‑
CAR
‑
T治疗影响相对小的检测和分析技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的在于提供一种新的用于检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的技术。
[0007]本专利技术的一个方面提供了一种用于流式细胞术检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的试剂组合物，该试剂组合物包括第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体，应用时流式细胞术检测采用二管并行方案，其中：第一组抗体包括：抗CD99抗体、抗CD1a抗体、抗CD34抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD8抗体、抗CD7抗体、抗CD45抗体、抗CD2抗体；第一组抗体中的各抗体用于加入到待测样本呈单个细胞悬液状态的第一流式管中；第二组抗体包括：抗CD3抗体、抗CD7抗体、抗CD16抗体、抗CD56抗体、抗CD45抗体；第二组抗体中的各抗体用于加入到待测样本呈单个细胞悬液状态的第二流式管中；第三组抗体包括：抗胞核TdT抗体、抗胞浆CD3抗体；第三组抗体中的各抗体用于加入到已加入第二组抗体且进行破膜处理后的第二流式管中。
[0008]本专利技术的试剂组合物可应用于流式细胞术检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病，针对T
‑
ALL这种异质性非常强的疾病，尤其是CD7
‑
CAR
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T后CD7细胞标志可能减弱或者丢失的病例，纳入了成熟标志CD4、CD8、CD3，同时组合使用原始细胞标志和T细胞标志进行设门检测，可以有效设门选出各亚群T细胞，且通过合理安排多维参数空间位置，可将每一个微妙变化进行叠加，从而一步快速观察多个参数组合，降低漏诊概率。且可同时进行免疫评价。
[0009]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的试剂组合物中，各抗体均为单克隆抗体。
[0010]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的试剂组合物中，各抗体均为荧光素标记的抗体。优选地，第一组抗体中各抗体的荧光素标记可以分别为：FITC、PE、PerCP
‑
Cy5.5、PE
‑
Cy7、APC、APC
‑
Cy7、BV421、V500、BV605。其中，CD34和CD1a使用共同一个荧光通道，可起到减少荧光通道的作用。各抗体荧光素可以互相交换。更优选地，第一组抗体中，抗CD99抗体、抗CD1a抗体、抗CD34抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD8抗体、抗CD7抗体、抗CD45抗体、抗CD2抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PE、PerCP
‑
Cy5.5、PE
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Cy7、APC、APC
‑
Cy7、BV421、V500、BV605。
[0011]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的试剂组合物中，第二组抗体中各抗体的荧光素标记可以分别为：PerCP
‑
Cy5.5、APC、APC...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于流式细胞术检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的试剂组合物，其特征在于，该试剂组合物包括第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体，应用时流式细胞术检测采用二管并行方案，其中：第一组抗体包括：抗CD99抗体、抗CD1a抗体、抗CD34抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD8抗体、抗CD7抗体、抗CD45抗体、抗CD2抗体；第一组抗体中的各抗体用于加入到待测样本呈单个细胞悬液状态的第一流式管中；第二组抗体包括：抗CD3抗体、抗CD7抗体、抗CD16抗体、抗CD56抗体、抗CD45抗体；第二组抗体中的各抗体用于加入到待测样本呈单个细胞悬液状态的第二流式管中；第三组抗体包括：抗胞核TdT抗体、抗胞浆CD3抗体；第三组抗体中的各抗体用于加入到已加入第二组抗体且进行破膜处理后的第二流式管中。2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，各抗体均为单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，各抗体均为荧光素标记的抗体；第一组抗体中，抗CD99抗体、抗CD1a抗体、抗CD34抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD8抗体、抗CD7抗体、抗CD45抗体、抗CD2抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PE、PerCP
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Cy5.5、PE
‑
Cy7、APC、APC
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Cy7、BV421、V500、BV605；第二组抗体中，抗CD3抗体、抗CD7抗体、抗CD16抗体、抗CD56抗体、抗CD45抗体的荧光素标记按顺序分别为：PerCP
‑
Cy5.5、APC、APC
‑
Cy7、BV421、V500；第三组抗体中，抗TdT抗体的荧光素标记为FITC，抗胞浆CD3抗体的荧光素标记为PE或APC。4.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于：第一组抗体为抗CD99抗体、抗CD1a抗体、抗CD34抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD8抗体、抗CD7抗体、抗CD45抗体、抗CD2抗体按照5：5：5：5：3：2：3：3：3：3的体积比混合的混合物；第二组抗体为抗CD3抗体、抗CD7抗体、抗CD16抗体、抗CD56抗体、抗CD45抗体按照5：2：3：3：3的体积比混合的混合物；第三组抗体为抗TdT抗体和抗胞浆CD3抗体按照2：5的体积比混合的混合物。5.一种用于检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病微小残留病及淋巴细胞亚群的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括第一容器、第二容器和第三容器，各容器分别容置权利要求1
‑
4任一项所述的试剂组合物的第一组抗体、第二组抗体和第三组抗体。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：红细胞裂解液、破膜剂、缓冲液、与流式细胞仪配套使用的流式管中的一种或多种。7.权利要求1
‑
4任一项所述的试剂组合物在制备用于检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的流式细胞上机样品中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制备用于检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的流式细胞上机样品的过程包括步骤：（1）将待测样本分别加入到第一、第二两个流式管中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1
×
106/管
‑ꢀ1×
107/管；所述待测样本为骨髓或外周血；（2）将步骤（1）处理得到的样本，第一流式管中加入权利要求1
‑
4任一项所述的试剂组合物中的第一组抗体，第二流式管中加入权利要求1
‑
4任一项所述的试剂组合物中的第二
组抗体，混匀后室温避光孵育；（3）向步骤（2）孵育后的第...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卉，陈曼，王爱先，宫美维，吴雪英，甄军毅，杜晴，郭亚，
申请(专利权)人：河北燕达陆道培医院有限公司，
类型：发明
国别省市：