检测食品中产黄曲霉毒素真菌的引物探针组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测食品中产黄曲霉毒素真菌的引物探针组合及试剂盒，所述产黄曲霉毒素真菌包括黄曲霉和寄生曲霉，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示，所述探针序列的5

【技术实现步骤摘要】
检测食品中产黄曲霉毒素真菌的引物探针组合及试剂盒


[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体地，涉及一种检测食品中产黄曲霉毒素真菌的引物探针组合及试剂盒。

技术介绍

[0002]真菌广泛分布于自然界各级食物链中，种类繁多、数量庞大、与人类的关系十分密切，在适宜的温、湿度条件下，有些产毒素真菌就会在食品（原料及加工产品）、粮食和饲料中生长繁殖，产生真菌毒素。真菌毒素普遍存在于农副产品或动物饲料中，误食后可引起人类和动物的急性或慢性中毒，可损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织，致畸、致癌等。
[0003]黄曲霉毒素(AFT)是一种具有高毒性和致癌性，极易污染各种食品和农产品的真菌毒素，主要为黄曲霉和寄生曲霉的次生代谢产物。粮食和饲料被AFT污染的概率很高，可通过直接或间接进入人类食物链，当人们食用了含有AFT的食物会严重危害到身体健康。AFT主要污染花生、玉米、棉籽、禽蛋、小麦、乳与乳制品等产品，世界卫生组织推荐了食品、饲料中的AFT最大允许残留量标准，中国、美国和欧盟也相继制定了最大允许残留量标准，可见世界各国对AFT的污染极为重视。
[0004]目前产毒素真菌的检测方法主要是传统微生物培养法和普通PCR法，前者基于形态学观察，根据孢子形态、菌丝侵染和产孢方式等特征对产毒素真菌进行分类鉴定，普通PCR检测过程需在扩增后对产物进行分析验证。两种方法操作均存在步骤繁琐、检验周期长的局限性，在应急监测中难以应用。实时荧光PCR方法边扩增边检测，提高了检测速度，具有特异性更强、灵敏度更高、检测周期更短，已成为一种成熟的主流基因检测平台，该方法应用于产毒素真菌的检验，能够较好地弥补传统方法在检测工作中的不足，大幅缩短检测时间，简化操作流程，满足进出口食品产毒素真菌快速检测的需求。
[0005]因此，基于实时荧光PCR方法的优势以及对产黄曲霉毒素真菌快速检测的需求，开发一种便捷、快速的产黄曲霉毒素真菌快速检测方法，以满足基层实验室对食品中主要产毒素真菌的快速检测。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供一种新型的检测食品中产黄曲霉毒素真菌的引物探针组合及试剂盒。本专利技术作为一种便捷、快速的产黄曲霉毒素真菌快速检测方法，可以满足基层实验室对食品中主要产毒素真菌的快速检测的需求。
[0007]本专利技术的技术方案为：一种检测食品中产黄曲霉毒素真菌的引物探针组合，所述产黄曲霉毒素真菌包括黄曲霉和寄生曲霉，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示，所述探针序列的5
’
端修饰有荧光基团、3
’
端修饰有荧光猝灭基团的物质；所述荧光基团为
qPCR），引物探针各1
µ
L，DNA模板5
ꢀµ
L，用双蒸水补足总体积25
ꢀµ
L。
[0020]进一步的，所述引物探针的终浓度均为0.4
ꢀµ
mol/L。
[0021]进一步的，所述试剂盒的扩增反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性5s，60℃退火45s，收集荧光信号；45个循环。
[0022]本专利技术中，采用的实时荧光PCR技术是在PCR基础上，加入一条与模板DNA匹配的、两端有荧光标记的寡核苷酸探针。PCR每进行一次循环，合成新链数与释放的荧光基团呈对应关系，即PCR产物的量与荧光信号的强度呈对应关系。当荧光信号超过所设定的阈值时，荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光基团的增加量可以间接地体现目的片段的扩增量。样品的模板DNA进行实时荧光PCR扩增，观察实时PCR的增幅曲线，从而对食品中的产毒素真菌进行快速检测。
[0023]本专利技术中，曲霉由于种类繁多，种之间、种属之间(与其他属比如念珠菌属、隐球菌属等)的核酸序列同源性较高，同时，整个真菌基因组发生变异的几率远大于人类基因组，使得可选择作为靶基因序列进行种属检测的基因序列不多，因此，对于设计特异性检测常见曲霉比如黄曲霉、寄生曲霉等的荧光PCR的引物和探针的难度就比较大。专利技术人通过大量创造性试验，找到最优的引物探针对。专利技术人对从乙酰辅酶A到黄曲霉毒素生物合成过程中发挥作用的20多种酶进行分析，发现ver
‑
1基因编码杂色曲霉素A脱氢酶转化伪柄曲霉素，omt
‑
1基因编码调控柄曲霉素转甲氧基酶转化为黄曲霉毒素前体O
‑
甲基柄曲霉素，基因aflR作为调控基因编码特异性的DNA结合蛋白，活化黄曲霉毒素生物合成途径。这些基因具有种属特异性和高度的保守性，因此在分析参与毒素合成的基因或者参与调控的分子机制中，可作为探针，也可作为特异性的分子标记产黄曲霉毒素的菌株。但由于目标核苷酸特异型片段较小，要在其中设计合适的引物探针，仅仅利用软件进行分析和比对，找到的引物探针不能满足实验要求，必需再通过创造性试验，进行人工调整和比对，并进行大量实验以从中筛选最优的引物探针对。
[0024]本专利技术设计的引物探针均能有效扩增出相应的靶基因，对其目标基因扩增荧光信号强，出现时间早，扩增效果好。
[0025]本专利技术提供的引物探针组合能够实现黄曲霉和寄生曲霉的同时检测，检测特异型强，灵敏度高、检测速度快。本专利技术的试剂盒能成功从食品样品中快速检测出主要产毒素真菌，方法具有良好的排他性和包容性，同常见真菌和常见致病菌均无交叉反应，产毒素真菌关键基因的核酸检测灵敏度为2.0
×
10
‑4ng/
µ
L。检测结果与普通PCR方法结果一致。该方法特异性强、灵敏度高、快速、环保，适用于基层实验室对食品中主要产毒素真菌的快速检测。
附图说明
[0026]图1为实施例1
‑
3引物探针的特异性验证结果，图中A
‑
D依次为对筛选出的ITS、aflR、omt
‑
1、ver
‑
1引物探针特异性检测结果，图中数字为菌株序号）；图2为梯度稀释的阳性菌株核酸ITS基因的灵敏度检测结果，图中A
‑
C依次为荧光PCR扩增图谱、标准曲线、普通PCR电泳图；图3为梯度稀释的阳性菌株核酸aflR基因的灵敏度检测结果，图中A
‑
C依次为荧光PCR扩增图谱、标准曲线、普通PCR电泳图；图4为梯度稀释的阳性菌株核酸omt
‑
1基因的灵敏度检测结果，图中A
‑
C依次为荧
光PCR扩增图谱、标准曲线、普通PCR电泳图；图5为梯度稀释的阳性菌株核酸ver
‑
1基因的灵敏度检测结果，图中A
‑
C依次为荧光PCR扩增图谱、标准曲线、普通PCR电泳图；图6为染菌样品黄曲霉毒素检测谱图。
具体实施方式
[0027]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本专利技术进行进一步的详细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测食品中产黄曲霉毒素真菌的引物探针组合，所述产黄曲霉毒素真菌包括黄曲霉和寄生曲霉，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示， 所述探针序列的5
’
端修饰有荧光基团、3
’
端修饰有荧光猝灭基团的物质；所述荧光基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1。2.一种检测食品中产黄曲霉毒素真菌的引物探针组合，所述产黄曲霉毒素真菌包括黄曲霉和寄生曲霉，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示，所述探针为在SEQ ID NO.6所示， 所述探针序列的5
’
端修饰有荧光基团、3
’
端修饰有荧光猝灭基团的物质，所述荧光基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1。3.一种检测食品中产黄曲霉毒素真菌的引物探针组合，所述产黄曲霉毒素真菌包括黄曲霉和寄生曲霉，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.8所示，所述探针为在SEQ ID NO.9所示， 所述探针序列的5
’
端修饰有荧光基团、3...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯家望，姚丽锋，黎财慧，丁琦，张晴阳，周昱晨，游淑珠，符家忍，王小玉，
申请(专利权)人：拱北海关技术中心，
类型：发明
国别省市：