一种采用可溶性的标签为载体制备司美诺肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用可溶性的标签为载体制备司美诺肽的方法；采用可溶性的HBA标签为载体的液相肽合成法，按司美诺肽的氨基序列依次接入相应的保护氨基酸得到全保护的司美诺肽标签结合物；在连接过程中，每一步的保护氨基酸偶联及脱Fmoc保护都是在HBA标签上执行。本发明专利技术采用了可溶性的Fmoc PAL amide Tag及Fmoc

【技术实现步骤摘要】
一种采用可溶性的标签为载体制备司美诺肽的方法


[0001]本专利技术涉及司美诺肽合成
，具体涉及一种采用可溶性的标签(Tag)为载体制备司美诺肽(Setmelanotide)的方法。

技术介绍

[0002]世界卫生组织报告显示，全球肥胖症患者自1975年以来已几乎增加了三倍。我国成人和儿童肥胖率以及因肥胖导致的经济成本上升非常显著。同时，肥胖症也增加了其它并发症的患病风险，如二型糖尿病、心血管疾病等的患病风险。
[0003]黑素皮质素(melanocortin)，也称促黑激素、促黑色素细胞激素、黑细胞促素等，是一类肽类激素，其中包含促肾上腺皮质激素(ACTH)和各类黑色素细胞刺激素(MSH)。这类激素由前脑啡黑细胞促素皮促素(POMC)在脑下垂体产生，通过结合并激活黑素皮质素受体(melanocortin receptor)(MCR)产生作用。黑素皮质素受体(melanocortin receptor)(MCR)共有5种，且均为G蛋白偶联受体：在大脑中仅表达MC3R与MC4R两种受体，二者配体为α
‑
MSH，而刺鼠肽基因相关蛋白(Agouti
‑
related peptide)(AgRP)是其内源性拮抗剂。
[0004]黑素皮质素系统在哺乳动物体内与瘦蛋白等竞争，共同调节了摄食活动。目前已知的释放黑素皮质素的神经仅有弓状核，位于下丘脑。弓状核其中有POMC神经细胞和AgRP神经细胞等神经元。当POMC神经释放α
‑
MSH，食欲减退；而当AgRP神经细胞释放AgRP(Agouti
‑
related peptide)，食欲则增强。瘦蛋白是一种负责调控饱腹感的蛋白，食欲刺激素(Ghrelin)则是一种负责刺激食欲的激素，二者共同调节了大脑内黑素皮质素系统的上游通路。这两种激素共同参与黑素皮质素在内的激素调节，而瘦蛋白
‑
黑素皮质素之间在大脑内的平衡如果失去，则会引起早发的肥胖在内的各类新陈代谢类疾病，还将抑制免疫功能。
[0005]黑皮质素受体4(MC4R)主要在下丘脑中表达，参与控制食物摄取，能量消耗，体重维持等。实验和临床证据也表明，MC4R是肥胖症治疗的重要靶点。司美诺肽是一款寡肽类黑素皮质素
‑
4受体(melanocortin
‑
4 receptor，MC4R)激动剂，作用于人和大鼠黑皮质素4受体；MC4R是机体独立调节能量消耗和食欲的关键生物学通路的一部分。基因变异可能会损害MC4R通路的功能，而这可能会导致极度饥饿(食欲过盛)和早发性严重肥胖。司美诺肽作为一种靶向疗法，恢复受损MC4R通路的功能，重新建立罕见肥胖遗传性疾病患者的能量消耗和食欲控制，减少饥饿感、降低体重。
[0006]司美诺肽是内源性黑素皮质素肽α
‑
MSH(α黑素细胞刺激素)的一种8个氨基酸环肽类似物。司美诺肽醋酸酯的化学名称为乙酰基
‑
L
‑
精氨酰
‑
L
‑
半胱氨酸
‑
D
‑
丙氨酰
‑
L
‑
组氨酸
‑
D
‑
苯丙氨酸基
‑
L
‑
精氨酰
‑
L
‑
色氨酰
‑
L
‑
半胱氨酸酰胺环(2
→
8)
‑
二硫化物醋酸酯。分子式为C49H68N18O9S2(无水游离碱)，分子量为1118.5道尔顿。
[0007]司美诺肽的化学结构式为：
[0008][0009]司美诺肽的制备方法已有报道，中国专利CN102686601A报道了应用液相(LPPS)片段缩合法制备司美诺肽的方法，该方法提供了含有8个氨基酸环型司美诺肽的制备方法，但由于司美诺肽中不含不易消旋的氨基酸，比如以半胱氨酸(Cys)或组氨酸(His)为片段的C末端氨基酸进行活化进行片段间酰胺键的连接可能产生非常严重的消旋副产物而导致产物不纯，增加纯化成本，并且由于此液相合成过程中频繁使用氯甲酸异丁基酯，其形成酰胺键过程条件苛刻，经常需要使用
‑
15℃以下的温度缩合，过程控制困难不便于大规模生产，而且每一个氨基酸缩合后的酸性水溶液洗涤、水洗或碱性水溶液洗涤均会产生大量的含有机废水，后续的处理成本非常高。中国专利CN111718408A提供了一种固相法(SPPS)制备司美诺肽的方法，该方法采用含有氨基的树脂采用从C末端按照氨基酸顺序逐个向N末端缩合的方法制备司美诺肽，其减少了液相片段制备过程中的消旋问题，但固相合成多肽本身采用的固相载体树脂价格昂贵；每个保护氨基酸及缩合剂在缩合过程中的过量使用引起的成本增加，比如专利中提到的保护氨基酸及缩合剂过量优选为2.5
‑
4倍，较液相合成氨基酸1.0
‑
1.5倍比例成本大大增加；并且缩合及脱除Fmoc的溶剂洗涤会产生大量的有机废液，由于成分复杂回收及处理困难，焚烧处理又会增加环境污染；并且专利中的司美诺肽Cys2‑
Cys8位的二硫键环化优选了碘作为氧化剂氧化，这种氧化方式容易使肽序中的色氨酸发生氧化产生环化杂质，并且固相合成过程中没有中间体的纯化步骤从而导致合成过程产生的杂质一直到合成切断完成才进行纯化，其纯化成本会非常高。

技术实现思路

[0010]基于以上现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种采用可溶性的标签(Tag)为载体制备司美诺肽(Setmelanotide)的方法；该方法保护氨基酸使用量少，试剂使用量少，消旋副产物低，收率高，纯化简单、成本可控、环境友好，可以满足司美诺肽原料的制备。
[0011]本专利技术采用一种疏水苯醇(HBAs)作为LPPS中的可溶性标签，它是一种相对固相载体来讲较小的疏水性小分子，有明确的结构，在芳香环上可以通过改变它们的替代模式进行微调并连接小分子手臂(Linker)，形成适合C末端为酰胺的多肽产物。
[0012]具体而言，本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0013]本专利技术提供一种司美诺肽的制备方法，采用可溶性的HBA标签为载体的液相肽合
成法。
[0014]作为本专利技术的一个实施方案，所述可溶性的HBA标签为Fmoc PAL amide Tag或Fmoc
‑
Rink amide Tag。
[0015]作为本专利技术的一个实施方案，所述可溶性的HBA标签为：
[0016][0017]作为本专利技术的一个实施方案，按司美诺肽的氨基序列依次接入相应的保护氨基酸得到全保护的司美诺肽标签结合物；在连接过程中，每一步的保护氨基酸偶联及脱Fmoc保护都是在HBA标签上执行。且Fmoc保护氨基酸缩合及去除Fmoc保护基团是在溶液状态中进行。
[0018]作为本专利技术的一个实施方案，所述连接包括如下步骤：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种司美诺肽的制备方法，其特征在于，采用可溶性的HBA标签为载体的液相肽合成法。2.根据权利要求1所述的司美诺肽的制备方法，其特征在于，所述可溶性的HBA标签为Fmoc PAL amide Tag或Fmoc
‑
Rink amide Tag。3.根据权利要求1所述的司美诺肽的制备方法，其特征在于，所述可溶性的HBA标签为：4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的司美诺肽的制备方法，其特征在于，按司美诺肽的氨基序列依次接入相应的保护氨基酸得到全保护的司美诺肽标签结合物；在连接过程中，每一步的保护氨基酸偶联及脱Fmoc保护都是在HBA标签上执行。5.根据权利要求4所述的司美诺肽的制备方法，其特征在于，所述连接包括如下步骤：S1、以脱Fmoc试剂脱除Fmoc PAL amide Tag或Fmoc
‑
Rink amide Tag连接臂上的Fmoc，得PAL amide Tag或Rink amide Tag；S2、偶联Fmoc保护氨基酸、封头：S2
‑
1、加入Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH,缩合试剂进行偶联反应；加入一级胺或二级胺使过量的Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH的羧基活化端封闭形成Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
CA；或S2
‑
2、加入Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
OH,缩合试剂进行偶联反应；加入一级胺或二级胺使过量的Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
OH的羧基活化端封闭形成Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
CA；S3、脱Fmoc：S3
‑
1、加入脱Fmoc试剂脱除步骤S2
‑
1得到的Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
Rink amide Tag上的Fmoc及Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
CA上的Fmoc，得到H
‑
Cys(Trt)
‑
Rink amide Tag；或加入脱Fmoc试剂脱除步骤S2
‑
1得到的Fmoc
‑
Cys(Trt)PAL amide Tag上的Fmoc及Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
CA上的Fmoc，得到H
‑
Cys(Trt)PAL amide Tag；或加入脱Fmoc试剂脱除步骤S2
‑
2得到的Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
Rink amide Tag上的Fmoc及Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
CA上的Fmoc，得到H
‑
Cys(Mmt)
‑
Rink amide Tag；或加入脱Fmoc试剂脱除步骤S2
‑
2得到的Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
PAL amide
‑
Tag上的Fmoc及Fmoc
‑
Cys(Mmt)
‑
CA上的Fmoc，得到H
‑
Cys(Mmt)
‑
PAL amide Tag；
S4、按司美诺肽的氨基序列顺序，根据步骤S2、S3的方法再进行下一个偶联Fmoc保护氨基酸、封头、脱Fmoc直至司美诺肽序列缩合完毕，得到全保护的司美诺肽标签结合物。6.根据权利要求5所述的司美诺肽的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬明放，张震，张艳，石海芳，何文君，
申请(专利权)人：申联生物医药上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：