一种双酶偶联合成(S)-香茅醇的方法技术

本发明专利技术公开了供了一种双酶偶联合成(S)

【技术实现步骤摘要】
一种双酶偶联合成(S)
‑
香茅醇的方法
(一)

[0001]本专利技术属于生物催化领域，涉及一种以橙花醇为底物基于辅酶自循环的(S)
‑
香茅醇合成方法。
(二)
技术介绍

[0002]香茅醇具有玫瑰香气，是香水的重要配料。(S)
‑
香茅醇的香型不同于(R)
‑
香茅醇，可满足高端香水的配制要求。(S)
‑
香茅醇具有多种生物活性，可以抑制伤寒杆菌及金黄色葡萄杆菌活性。(S)
‑
香茅醇是合成手性化学品的重要中间体，可用于合成全顺式的玫瑰醚、(S)
‑
胡薄荷酮和3(S)
‑
甲基
‑
庚酸等。
[0003](S)
‑
香茅醇的化学合成通常以橙花醇、香茅醛、柠檬醛等作为底物，利用化学加氢得到(S)
‑
香茅醇。香茅醛和柠檬醛既有C＝C键，也有C＝O键，它们的还原在化学选择性和对映体选择性上仍是挑战。橙花醇含有两个C＝C键，它的还原合成(S)
‑
香茅醇需要满足严格的位点选择性和对映体选择性。与化学法相比，生物法还原橙花醇、香茅醛、柠檬醛等生成(S)
‑
香茅醇，具有优异的位点选择性、化学选择性和对映体选择性，并且条件温和、绿色环保。然而，由于缺乏高活力的专用酶，目前生物法还达不到实际应用的要求。此外，生物法还原橙花醇、香茅醛或柠檬醛需要配置辅酶循环体系，为了驱动辅酶循环，往往需要添加过量的辅底物，因而降低了原子经济性。
[0004]为了提高(S)
‑
香茅醇的合成效率，生物催化剂选用了高活力的醇脱氢酶YsADH 和老黄酶NemR
‑
PS。为了提高生物催化合成(S)
‑
香茅醇的原子经济性，反应设计融合了辅酶自循环体系：醇脱氢酶YsADH利用NADP
+
催化橙花醇脱氢生成橙花醛和 NADPH，而老黄酶NemR
‑
PS利用NADPH还原橙花醛生成(S)
‑
香茅醛，该过程辅酶自循环，不需要辅底物驱动；生成的(S)
‑
香茅醛由醇脱氢酶YsADH进一步还原成光学纯的(S)
‑
香茅醇，所建立的方法具有严格的位点选择性、化学选择性以及对映体选择性。与专利文献(申请号：2020112165477；一种双酶偶联合成(R)
‑
香茅醇的方法) 相比，老黄酶NemR
‑
PS替代老黄酶OYE2y
‑
HG，与醇脱氢酶YsADH相偶联催化不同的底物(橙花醇)转化为不同的产物(S)
‑
香茅醇，适应底物浓度达100mM，反应更为高效。与专利文献(申请号：2021108203589；一种三酶共表达重组菌及其在(S)
‑ꢀ
香茅醇合成中的应用)相比，老黄酶NemR
‑
PS与醇脱氢酶YsADH二酶偶联替代老黄酶NemR
‑
PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDH
M6
三酶偶联，利用不同的底物获得了相同的产物(S)
‑
香茅醇；反应不需要辅底物葡萄糖，提高了反应的原子经济性。
(三)
技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种双酶偶联合成(S)
‑
香茅醇的方法，以橙花醇为底物基于辅酶自循环的(S)
‑
香茅醇合成方法，醇脱氢酶YsADH利用NADP
+
催化橙花醇脱氢生成橙花醛和NADPH，而老黄酶NemR
‑
PS利用NADPH还原橙花醛生成(S)
‑
香茅醛，该过程辅酶自循环，不需要辅底物驱动；(S)
‑
香茅醛在醇脱氢酶YsADH催化下进一步还原生成光学纯的(S)
‑
香茅醇。该方法原子经济性高，具有优越的位点选择性、化学选择性和对映体选择性。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：
[0007]本专利技术提供一种双酶偶联合成(S)
‑
香茅醇的方法，所述方法为：以含醇脱氢酶 YsADH基因的工程菌和含老黄酶NemR
‑
PS基因的工程菌各自经发酵培养获得的湿菌体混合后作为催化剂，以橙花醇为底物，以NADP
+
为辅酶，以pH 6
‑
9缓冲液为反应介质构成反应体系，在25
‑
55℃、0
‑
900rpm条件下反应完全后，反应液分离纯化，最终获得(S)
‑
香茅醇。
[0008]进一步，所述醇脱氢酶YsADH基因来源于约克氏菌(Yokenella sp.WZY002)，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述约克氏菌 (Yokenella sp.WZY002)保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC No：M2013099，保藏日期：2013年3月22 日，已在专利申请CN201310188883.9中公开。
[0009]进一步，所述含醇脱氢酶YsADH基因的工程菌是将醇脱氢酶YsADH基因导入大肠杆菌构建获得的；具体为：将SEQ ID NO.2所示醇脱氢酶YsADH编码基因插入 pET28b载体的Nco I和Hind III限制性酶切位点，得到重组载体pET28b
‑
YsADH；将重组载体pET28b
‑
YsADH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28b
‑
YsADH。
[0010]进一步，所述老黄酶NemR
‑
PS基因来源于斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii； Department of Infectious Diseases,National Institute of Health Dr.Ricardo Jorge,Lisbon, Portugal)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]进一步，所述含老黄酶NemR
‑
PS基因的工程菌是将老黄酶NemR
‑
PS基因导入大肠杆菌构建获得的；具体为：将SEQ ID NO.4所示老黄酶NemR
‑
PS编码基因插入 pET28b载体的Nco I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pET28b
‑
NemR
‑
PS；将重组载体pET28b
‑
NemR
‑
PS导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b
‑
NemR...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双酶偶联合成(S)
‑
香茅醇的方法，其特征在于所述方法为：以含醇脱氢酶YsADH基因的工程菌和含老黄酶NemR
‑
PS基因的工程菌各自经发酵培养获得的湿菌体混合后作为催化剂，以橙花醇为底物，以NADP
+
为辅酶，以pH 6
‑
9缓冲液为反应介质构成反应体系，在25
‑
55℃、0
‑
900rpm条件下反应完全后，反应液分离纯化，最终获得(S)
‑
香茅醇。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述醇脱氢酶YsADH基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；老黄酶NemR
‑
PS基因核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含醇脱氢酶YsADH基因的工程菌按如下方法构建：将醇脱氢酶YsADH编码基因插入pET28b载体的Nco I和Hind III限制性酶切位点，得到重组载体pET28b
‑
YsADH；将重组载体pET28b
‑
YsADH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b
‑
YsADH。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含老黄酶NemR
‑
PS基因的工程菌按如下方法构建：将老黄酶NemR
‑
PS编码基因插入pET28b载体的Nco I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pET28b
‑
NemR
‑
PS；将重组载体pET28b
‑
NemR
‑
PS导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b
‑
NemR
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PS。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含醇脱氢酶YsADH基因工程菌的湿菌体与含老黄酶NemR
‑
PS基因工程菌的湿菌体以质量比0.25
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4:1混合，所述催化剂加入量以湿菌体总量计为120g/L。6.如权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：应向贤，邵帅，王崎舟，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：