一种活体荧光寿命成像光学系统和方法技术方案

本发明专利技术属于活体荧光成像技术领域，具体为一种活体荧光寿命成像光学系统和方法。本发明专利技术的成像光学系统包括：用于放置与固定待检测样本并具有三维定位功能的载物台，用于采集样本荧光信号的由成像放大系统、滤光片、成像镜头和荧光探测器组成的荧光信号采集单元，用于控制荧光探测器采样和激发光激发的相对时间的斩波器延时单元，包括外接高低电平触发信号激光器的激发单元（不同激发波长的光源可自由切换，满足不同活体样本需求）；用于处理采集到的系列荧光信号、最终重构荧光寿命成像图片的数据处理单元（计算机处理程序）。本发明专利技术结合不同寿命的荧光探针实现活体样本的肿瘤成像及标志物定量检测等功能，具有检测通量大和定量精度高等特点。度高等特点。度高等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种活体荧光寿命成像光学系统和方法


[0001]本专利技术属于荧光成像
，具体涉及一种荧光寿命成像光学系统和方法。

技术介绍

[0002]光学生物成像具有无辐射、高灵敏度、操作简单、高时间和空间分辨率、价格便宜等优势，现已经发展为生物医学基础研究和临床应用研究不可或缺的成像技术。在体外诊断中，传统的荧光成像技术通常是利用探针不同波长位置的发射进行多种生物标志物的标记和检测。然而在活体诊断中，由于不同发射波长的荧光被生物组织（如皮肤、肌肉、脂肪、骨骼等）中的吸收和散射不同，使得不同发射波长的荧光在活体内的衰减行为不同，从而无法实现基于传统光谱位置的多重定量检测。因此，目前利用光学的活体定量检测仍然面临很大的挑战。
[0003]相对于荧光发射波长和强度而言，荧光寿命是荧光探针的固有性质，与探针的浓度和外界激发强度无关，也不随组织穿透深度的变化而变化，因此为活体以及细胞内生物物质的定量检测和分子动力学分析提供了有力的工具。目前基于荧光寿命成像的技术主要有两种：频域法和时域法。日本大阪大学最早提出频域法测量荧光寿命，其优点是原理简单，对设备要求不高，然而其对多组分样品荧光寿命的分辨过程较为繁琐，成像速度受到限制。在时域方法中，条纹相机法需要通过两个方向的扫描实现二维成像。这种方法的时间分辨率较高，但动态范围通常较窄，且成像速度比较慢。时间相关单光子计数法（TCSPC）作为目前常用的时域荧光寿命成像方法，它通过逐点扫描统计的方法避免了荧光强度的直接测量，因而信噪比高，但由于每个像素点拟合成信噪比比较好的衰减曲线至少需要上千个光子，所以成像速度通常都比较慢。相比之下，门控探测法主要用于宽场成像方式，且对于单个组分荧光寿命测量理论上只需要两个不同时刻的荧光强度，所以在上述寿命成像过程中速度是最快的。虽然目前这种方法取得了一定的科研成果，但是所使用的装置也都是自主搭建的，操作繁琐，更没有触及仪器研制及技术标准的制定。因此，为了实现高通量和高精确的活体以及细胞内生物物质的定量和分子动力学分析，研制和专利技术活体荧光寿命成像光学系统迫在眉睫。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种活体荧光寿命成像光学系统和方法，以实现高通量和高精度的活体生物物质的定量检测，具有操作简单、成像方便、出结果速度快的特点。
[0005]本专利技术提供的是活体荧光寿命成像光学系统，包括激光器、光纤耦合准直器、载物台、活体样本、滤光片、成像镜头、斩波器、成像放大系统、荧光探测器、计算机、采集卡；在同一光轴上依次顺序放置载物台、活体样本、滤光片、成像镜头、斩波器、成像放大系统、荧光探测器；激光器发出的光经过斩波器调制后通过光纤耦合准直器后作用于活体样本上，在活体样本上所激发出的荧光经过滤光片、成像镜头、斩波器、成像放大系统，最终成像于荧光探测器上，通过协同斩波器控制激光器照射活体样本时产生的脉冲荧光信号和荧光探测
器的采集时间窗口，使得荧光探测器的采集窗口相对于脉冲荧光信号出现一系列延迟，得到一系列不同荧光强度的图像，由计算机通过逐步积分法获得荧光寿命图像。
[0006]本专利技术中，所述荧光探测器包括可见光面阵探测器、短波红外面阵探测器以及检测波长覆盖可见至近红外波段的面阵探测器。
[0007]进一步地，所述可见光面阵探测器的响应波长为300~1000 nm，所述近红外面阵探测器的响应波长为900~2500 nm，所述检测波长覆盖可见至近红外波段的面阵探测器的响应波长为400~2500 nm。
[0008]本专利技术中，所述成像放大系统由两片可见光或近红外区域消色差或非球面凸透镜组成。
[0009]进一步地，所述两片透镜的焦距为20 ~200 mm，透过波段为300~1000 nm，900~2500 nm或400~2500 nm，透过率>50%。
[0010]本专利技术中，所述滤光片为可见光或近红外长通、短通或带通滤光片。
[0011]进一步地，所述滤光片OD值>2,适应波长范围为300~2500 nm。
[0012]本专利技术中，所述成像镜头为透可见光、透近红外光或同时透可见以及近红外光成像镜头。
[0013] 进一步地，所述镜头的焦距为8 ~50 mm定焦镜头，镜头F数为1.4。
[0014]本专利技术中，所述载物台可上下前后左右六个方向移动，电动可调，由软件控制。
[0015]进一步地，所述载物台每个维度的行程为0~20 cm，移动速度为1~10 mm/s，可通过控制软件进行调节。
[0016]本专利技术中，所述斩波器包括斩波器主体以及斩波器控制器，斩波器外壳上紧贴其叶片制作有通光小孔；该通光小孔位于透镜组和镜头的焦点位置。
[0017]进一步地，所述斩波器的频率为0~500 Hz连续可调，叶片占空比为50%；通光小孔直径为0.8
‑
1.2 mm。
[0018]本专利技术中，所述激光器为外接可高低电平调制多模光纤的激光器或本身可调谐的脉冲光纤激光器，激光器的出光口通过光纤耦合准直器，该光纤为液芯均匀化光纤，使得激光光斑均匀。
[0019]本专利技术中，所述激光器可以自由替换成不同发射波长的激光器，用于针对不同的荧光探针提供不同的激发波长。
[0020]例如，所述激光器发射波长可为488 nm、550 nm、632 nm、715 nm、740 nm、786 nm、808 nm、860 nm、915 nm、940 nm、980 nm、1064 nm、1177 nm、1280 nm或1550 nm等，功率在50 mW~50W,功率波动<5%,可通过外接高低电平进行发光调制。
[0021]本专利技术中，为增加信号强度，也可同时接入多个相同激发波长的激光器。
[0022]本专利技术中，所述液芯光纤，在5cm处光斑直径在3~4cm，出纤功率>80%。
[0023]所述光纤耦合准直器固定于光学接杆上，光学接杆固定于所述竖直移动载物台上，保证水平移动样品时，激光照射位置不变。
[0024]本专利技术中，所述计算机包含计算机处理程序（可以自己编写），用于控制采集卡和荧光探测器；采集卡用于采集不同延迟时间的荧光照片，同时处理采集到的荧光信号，得到最终的荧光寿命成像图片。
[0025]本专利技术中，所述激光器、光纤耦合准直器、活体样本、载物台、成像镜头、斩波器、成
像放大系统、滤光片、荧光探测器固定于暗箱之中，采集卡固定于计算机中。
[0026]本专利技术还涉及基于本专利技术上述装置的活体荧光寿命成像光学方法，具体步骤为：（1）以激光器为光源，通过斩波器调节实现对光源发射光的频率调制，其调制频率取决于活体样本的荧光寿命数值；通常调节斩波器的频率为17 Hz，65 Hz以及500 Hz；其信号由采集卡收集，然后通过采集卡的输出接口将信号提供给激光器，形成脉冲光；（2）脉冲光通过光纤准直器后激发所述载物台上的注入了荧光探针的活体样品（如注入荧光探针的小鼠）发出相匹配频率的脉冲荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种活体荧光寿命成像光学系统，其特征在于包括激光器、光纤耦合准直器、载物台、活体样本、滤光片、成像镜头、斩波器、成像放大系统、荧光探测器、计算机、采集卡；在同一光轴上依次顺序放置载物台、活体样本、滤光片、成像镜头、斩波器、成像放大系统、荧光探测器；激光器发出的光经过斩波器调制后通过光纤耦合准直器后作用于活体样本上，在活体样本上所激发出的荧光经过滤光片、成像镜头、斩波器、成像放大系统，最终成像于荧光探测器上，通过协同斩波器控制激光器照射活体样本时产生的脉冲荧光信号和荧光探测器的采集时间窗口，使得荧光探测器的采集窗口相对于脉冲荧光信号出现一系列延迟，得到一系列不同荧光强度的图像，由计算机通过逐步积分法获得荧光寿命图像。2.根据权利要求1所述的活体荧光寿命成像光学系统，其特征在于：所述荧光探测器包括可见光面阵探测器、短波红外面阵探测器以及检测波长覆盖可见至近红外波段的面阵探测器；所述成像放大系统由两片可见光或近红外区域消色差或非球面凸透镜组成；所述滤光片为可见光或近红外长通、短通或带通滤光片；所述成像镜头为透可见光、透近红外光或同时透可见以及近红外光成像镜头；所述载物台可上下前后左右六个方向移动，电动可调，由软件控制；所述斩波器包括斩波器主体以及斩波器控制器，斩波器外壳上紧贴其叶片制作有通光小孔；该通光小孔位于透镜组和镜头的焦点位置；所述激光器为外接可高低电平调制多模光纤的激光器或本身可调谐的脉冲光纤激光器，激光器的出光口通过光纤耦合准直器，该光纤为液芯均匀化光纤，使得激光光斑均匀。3.根据权利要求2所述的活体荧光寿命成像光学系统，其特征在于，所述可见光面阵探测器的响应波长为300~1000 nm，所述近红外面阵探测器的响应波长为900~2500 nm，所述检测波长覆盖可见至近红外波段的面阵探测器的响应波长为400~2500 nm。4.根据权利要求2所述的活体荧光寿命成像光学系统，其特征在于，所述两片透镜的焦距为20 ~200 mm，透过波段为300~1000 nm，900~2500 nm或400~2500 nm，透过率>50%。5.根据权利要求2所述的活体荧光寿命成像光学系统，其特征在于，所述滤光片OD值>2,适应波长范围为300~2500 nm。6.根据权利要求2所述的活体荧光寿命成像光学系统，其特征在于，所述镜头的焦距为8 ~50 mm定焦镜头，镜头F数为1.4。7.根据权利要求2所述的活体荧光寿命成像光学系统，其特征在于，所述载物台每个维度的行程为0~20 cm，移动速度为1~10 mm/s，可通过控制软件进行调节。8.根据权利要求2所述的活体荧光寿命成像光学系统，其特征在于，所述斩波器的频率为0~500 Hz连续可调，叶片占空比为50%；通光小孔直径为0.8
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1.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凡，凡勇，张洪新，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：