一种SARS
【技术实现步骤摘要】
一种木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选试剂盒及其应用
[0001]本专利技术涉及药物筛选领域，具体涉及一种SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选方法。
技术介绍
[0002]目前尚未发现临床批准的针对COVID-19的疫苗和药物，针对 COVID-19研究的技术攻关和药物、疫苗开发仍迫在眉睫。
[0003]SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶是2019-2020年全球大流行的新冠病毒 covid-19蛋白水解酶，在病毒复制过程中起重要的作用，因此也是抗病毒药研究的重要靶点。筛选该酶的抑制剂，对于寻找该病毒的特效药大有帮助。
[0004]目前使用的木瓜样蛋白酶的检测方法，大多是以Z-RLRGG-AMC/ RLRGG-AMC为底物的，该方法是沿用2003年SARS,2013年MERS的木瓜样蛋白酶的检测方法。使用该方法去检测2020年的covid-19是不准确的，可能会导致抑制剂的错筛和漏筛。因此，迫切需要更先进更科学的抑制剂筛选方法。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种操作简单方便，灵敏度高，特异性好，能够快速筛选SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶抑制剂的试剂盒方法。为达到以上目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种试剂盒，包括如下组分：
[0007]SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶、
[0008]底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)溶液、
[0009]硼酸硼砂缓冲液。
[0010]优选地，所述SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶其蛋白酶(YP_009725299.1), 购自Sino Biologica(Catalog Number:40593-V-07E),序列为 Glu1564-Val1880，分子量为36.79kDa；其纯度经SDS-PAGE检测>92％,浓度为0.1-1毫克/毫升；
[0011]优选地，所述底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)溶于二甲亚砜中，其浓度为0.1mM-10mM，其中Dabcyl是猝灭剂4-二甲胺偶氮苯4
’-
羧酸，Edans是荧光团5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸；
[0012]优选地，所述硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔每升；所述硼酸硼砂缓冲液的PH为7-9。
[0013]使用该试剂盒筛选SARS-Cov2木瓜样蛋白酶的抑制剂，其方法为：
[0014](1)SARS-Cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-60到-100℃冰箱中；
[0015](2)将SARS-Cov2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃，优选0至4℃) 里或冰(-4至4℃，优选0至4℃)上室温下融化，取0.1-2uL稀释于97-98uL 硼酸硼砂缓冲液中，加入检测板中；
[0016](3)将0.1mM-10mM抑制剂储液0.1-2uL加入步骤(2)获得的溶液中，微震荡沉静10-30分钟；
[0017](4)将底物肽0.1-2uL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37摄氏度孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，每1-5分钟采一点；
[0018](5)不加抑制剂组的荧光值(重复步骤(1)，(2),(4))，作为对照组。
[0019]该底物肽在SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶作用下，荧光团猝灭得以解除，利用反应前后荧光性质的差异实现对SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶的活性检测，并且该方法可以用于简单方便，特异性好的高通量抑制剂快速筛选。
附图说明
[0020]图1为实施例1不同浓度底物肽在酶代谢下荧光强度随时间变化图；
[0021]图2为实施例2底物肽被SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶水解的底物转化效率 v/E与底物浓度S的关系图；
[0022]图3为实施例2中RLRGG-AMC被SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶水解的底物转化效率v/E与底物浓度S的关系图；
[0023]图4为实施例3中不同抑制剂浓度下的抑制能力图。
具体实施方式
[0024]下面通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案。本领域技术人员应明白，所述实施例仅仅是为了帮助理解本专利技术，不应视为对本专利技术的具体限制。
[0025]本专利技术所述的SARS-Cov2木瓜样蛋白酶购自Sino Biological，底物肽 Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)委托GL biochem定制合成，硼酸硼砂缓冲液购自雷根生物。
[0026]本专利技术所述的试剂盒需要用荧光酶标仪进行荧光检测。
[0027]本实施例的试剂盒含有：
[0028]SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶(浓度为0.1mg/mL)、底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)(浓度为0.1mM-5mM)、硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)。
[0029]实施例1
[0030]具体实施过程为：
[0031](1)SARS-Cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
[0032](2)将SARS-Cov2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1uL稀释于98uL硼酸硼砂缓冲液(PH＝7.4)中，加入检测板中；
[0033](3)将底物肽(浓度分别为：0.1mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM， 5mM)1uL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37摄氏度孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，每1分钟采一点；
[0034]该底物肽在酶代谢下荧光强度随时间缓慢增强效果如下图1。
[0035]实施例2
[0036]具体实施过程如下：
[0037](1)SARS-Cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；
[0038](2)于室温下，将SARS-Cov2木瓜样蛋白酶冰上缓慢融化，取1uL于硼酸硼砂缓冲液
(PH＝7.4)98uL中，加入检测板中；
[0039](3)将底物肽溶液(储液浓度为0.1mM，0.25mM，0.5mM，1mM， 2.5mM，5mM)1uL加入上述缓冲液体系溶液中，孵育30min，边孵育边检测，使用荧光酶标仪监测342nm激发，采集496nm处的荧光发射值，每1 分钟采一点；该结果表示为底物转化效率与底物浓度的关系,即酶动力学性质，如图2所示，该结果表明该底物肽被SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶水解符合典型的米氏方程，该底物肽是SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶的经典底物；
[0040]同时用RLRGG-AMC(其中AMC是7-氨基香豆素)作为底物，(储液浓度为0.1mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM，5mM)1uL加入上述缓冲液体系溶液中，孵育30min，边孵育边检测，使用荧光酶标仪监测 345nm激本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选试剂盒，其特征在于，包括以下组分：SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶、底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)、硼酸硼砂缓冲液。2.根据权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于，所述SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶浓度为0.01-1mg/mL；优选地，所述底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)的浓度为0.1mM-5mM；优选地，所述硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔/升；所述硼酸硼砂缓冲液的PH为7-9。3.一种权利要求书1或2所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于筛选SARS-Cov2木瓜样蛋白酶的抑制剂。4.根据权利要求书3所述的试剂盒的应用，其特征在于，其筛选SARS-Cov2木瓜样蛋白酶的抑制剂的方法为：(1)SARS-Cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-60到-100℃冰箱中；(2)将SARS-Cov2木瓜样蛋白酶在冻存板里或冰上室温下融化，取...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩克利，贾燕，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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