一种筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的方法及筛选模型技术

本发明专利技术涉及一种筛选新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)小分子抑制剂的方法及筛选模型。该方法及筛选模型基于荧光偏振(fluorescence polarization)原理，以荧光探针FITC

【技术实现步骤摘要】
一种筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的方法及筛选模型


[0001]本专利技术属于医药生物
，具体的，涉及一种筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的方法及筛选 模型。

技术介绍

[0002]快速研制新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS
‑
CoV
‑
2)疫苗、人源化抗 体和抗新冠病毒药物已成为科学界面临的重大科学问题。尽管在研制新冠病毒疫苗方面取得了显著进展， 但对于未接种疫苗的个体或病毒高频基因突变导致疫苗保护力下降等情况，安全有效的广谱抗新冠病毒药 物也是至关重要的(Wang Z,et al.Nature,2021)。虽然一些候选抗病毒药物已被用于临床治疗，如瑞德西 韦、法匹拉韦、利巴韦林、替比夫定等，但在大规模临床试验中均显示疗效有限或无效，积极开发新型广 谱抗新冠病毒药物具有重要意义。
[0003]目前研究表明，进化高度保守的新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)在调控新冠病毒RNA复制 中具有重要的生物学功能，且人体缺乏与其同源的蛋白酶，已成为新型广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶 标之一(Morse JS,et al.Chembiochem,2020；Jin Z,et al.Nature,2020；Jin Z,et al.Biochem Biophys ResCommun,2021)。在高选择性新冠病毒Mpro小分子抑制剂的开发过程中，简便、快速、灵敏、经济的药 物高通量筛选模型的建立是其高效筛选与开发的重要基础和关键技术(戚海燕,等.生命的化学,2021)。 目前已报道的Mpro小分子抑制剂筛选方法主要包括虚拟筛选法、荧光共振能量转移法(fluorescenceresonance energy transfer,FRET)、荧光素酶报告基因筛选法、绿色荧光蛋白剪切互补法和表型筛选法等(LiZ,et al.Proc Natl Acad Sci USA,2020；Zhu W,et al.ACS Pharmacol Transl Sci,2020；Coelho C,et al.PLoSOne,2020；Hung HC,et al.Antimicrob Agents Chemother,2020；马玲,等.药学学报,2020；Rawson J,et al. Viruses,2021；Froggatt HM,et al.J Virol,2020；Rothan HA,et al.Mol Biotechnol,2021；Riva L,et al.Nature, 2020)。但上述筛选方法普遍存在假阳性率高、筛选成本高、操作繁琐、稳定性差、筛选周期长等缺点， 较大地限制了其在大规模高通量筛选中的应用(戚海燕,等.生命的化学,2021)。因此，积极开发简便、 快速、灵敏、经济的新型Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术首先涉及一种用于筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的方法，所述的方法包括如下步骤：
[0005](1)以大肠杆菌原核表达方法制备高活性Mpro重组蛋白。
[0006](2)添加待筛选化合物与Mpro重组蛋白共同孵育。
[0007]优选的，Mpro重组蛋白溶液(Mpro重组蛋白的浓度为100～2000nM)与待筛选化合物(浓度为1～ 5mM)按比例混合后，在室温下共同孵育20～60min。
[0008]更优选的，Mpro重组蛋白溶液(Mpro重组蛋白的浓度为400nM)与待筛选化合物(浓度为3mM) 按照1:29(v/v)的比例混合后，在室温下共同孵育40min。
[0009](3)以异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和Biotin标记的FITC
‑
Substrate
‑
Biotin多肽 (FITC
‑
S
‑
Biotin:FITC
‑
AVLQSGFRKK
‑
Biotin)作为Mpro水解底物，在室温下共同孵育5～60min。
[0010]优选的，FITC
‑
S
‑
Biotin浓度为20～100nM，加入的FITC
‑
S
‑
Biotin溶液的体积为步骤(2)的体系的 1/2～1/1(v/v)。加入FITC
‑
S
‑
Biotin后，室温孵育5～40min。
[0011]更优选的，FITC
‑
S
‑
Biotin浓度为60nM，加入的FITC
‑
S
‑
Biotin溶液的体积为步骤(2)的体系的2/3 (v/v)。加入FITC
‑
S
‑
Biotin后，室温孵育20min。
[0012](4)以亲和素终止水解反应，在室温下共同孵育1～30min，以多功能酶标仪检测mP值。
[0013]优选的，亲和素浓度为10～500nM，加入的亲和素溶液的体积为步骤(2)的体系的1/6～1/1(v/v)。 加入亲和素后，室温孵育1～10min，以多功能酶标仪检测mP值。
[0014]更优选的，亲和素浓度为300nM，加入的亲和素溶液的体积为步骤(2)的体系的1/3(v/v)。加入亲 和素后，室温孵育5min，以多功能酶标仪检测mP值。
[0015](5)绘制目标化合物的抑制曲线，计算目标化合物对新冠病毒主蛋白酶的IC
50
值。
[0016]步骤(1)所述的大肠杆菌原核表达方法制备高活性Mpro重组蛋白的方法为：
[0017]①
将密码子优化的Mpro基因连接到pET
‑
21a(+)表达载体中，构建重组质粒Mpro
‑
pET
‑
21a；
[0018]②
再将重组质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中，进行Mpro可溶表达，以HisTrap亲和层 析柱分离纯化新冠病毒Mpro重组蛋白。
[0019]步骤(5)所述的绘制目标化合物抑制曲线的步骤中，其抑制率的计算公式如下：
[0020][0021]本专利技术还涉及一种用于筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的荧光偏振筛选试剂盒，所述的试剂盒中 包含：
[0022](1)检测有效量的新冠病毒Mpro重组蛋白、荧光探针FITC
‑
S
‑
Biotin、亲和素；
[0023](2)必要的溶剂与试剂。
[0024]本专利技术还涉及所述的用于筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的荧光偏振筛选试剂盒在筛选新冠病 毒主蛋白酶小分子抑制剂中的应用。
[0025]本专利技术的有益效果如下：
[0026]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于筛选新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)小分子抑制剂的方法，所述的方法包括如下步骤：(1)以大肠杆菌原核表达方法制备高活性Mpro重组蛋白；(2)添加待筛选化合物与Mpro重组蛋白共同孵育；优选的，步骤(2)中，Mpro重组蛋白溶液(Mpro重组蛋白的浓度为100～2000nM)与待筛选化合物(浓度为1～5mM)按比例混合后，在室温下共同孵育20～60min；(3)以异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和Biotin标记的FITC
‑
Substrate
‑
Biotin多肽(FITC
‑
S
‑
Biotin:FITC
‑
AVLQSGFRKK
‑
Biotin)作为Mpro水解底物，在室温下共同孵育5～60min；优选的，步骤(3)中，FITC
‑
S
‑
Biotin浓度为20～100nM，加入的FITC
‑
S
‑
Biotin溶液的体积为步骤(2)的体系的1/2～1/1(v/v)。加入FITC
‑
S
‑
Biotin后，室温孵育5～40min；(4)以亲和素终止水解反应，在室温下共同孵育1～30min，以多功能酶标仪检测mP值；优选的，步骤(4)中，亲和素浓度为10～500nM，加入的亲和素溶液的体积为步骤(2)的体系的1/6～1/1(v/v)。加入亲和素后，室温孵育1～10min，以多功能酶标仪检测mP值；(5)绘制目标化合物的抑制曲线，计算目标化合物对新冠病毒主蛋白酶的IC
50
值；所述的新冠病毒主蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中：将Mpro重组蛋白溶液(Mpro重组蛋白的浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈云雨，司书毅，张晶，闫干干，李东升，李妍，许艳妮，陈明华，刘超，李顺旺，王晨吟，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：