检测VHL基因c.-195G>A位点突变的方法、引物和试剂盒技术

本发明专利技术公开了检测VHL基因c.

【技术实现步骤摘要】
检测VHL基因c.
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195G＞A位点突变的方法、引物和试剂盒


[0001]本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测VHL基因c.
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195G＞A位点突变的试剂盒，采用Touch
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down PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测患者体内VHL基因c.
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195G＞A位点的突变情况。

技术介绍

[0002]希佩尔
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林道(von Hippel
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Lindau，VHL)综合征是一种常染色体显性遗传的家族性肿瘤综合征，发生率约为1/36000，以视网膜、神经系统血管母细胞瘤，肾细胞癌，肾上腺嗜铬细胞瘤等为特征，中枢神经系统血管母细胞瘤和肾细胞癌是最常见的死亡原因。根据VHL综合征患嗜铬细胞瘤的风险，临床上可分为两大类型：I型(不患嗜铬细胞瘤)和Ⅱ型(患嗜铬细胞瘤)。Ⅱ型根据患者患肾透明细胞癌的危险性高低分为三类亚型：ⅡA(低危)、ⅡB(高危)以及ⅡC型(仅表现为嗜铬细胞瘤)。临床上VHL综合征以I型最为多见，其次为ⅡA型。
[0003]VHL综合征发病机制至今还不是完全清楚，其中研究比较多的是低氧诱导因子
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1(HIF
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1)通路。VHL基因是一种抑癌基因，位于常染色体3p25
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26区域，正常情况下，VHL蛋白可参与血管形成、细胞周期的调控并参与细胞外纤维连接素基质的形成或装配等，而VHL基因发生突变后导致其蛋白质结构发生改变，不能识别HIF
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α，造成HIF
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α无法降解，HIF
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1转录激活靶基因大量表达，如TGFα、VEGF、PDGFβ、NF
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κB等，从而引起细胞生长和微血管形成，加速血管母细胞瘤、肾细胞癌及与VHL病有关的其他肿瘤的生长。
[0004]VHL综合征的特征基因为VHL，研究显示所有VHL综合征患者都存在胚系VHL等位基因的异常，因此确诊VHL综合征需检测到VHL基因的异常。VHL基因中常发生种系突变的3个区域分别是：75
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82号密码子、157
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189号密码子、外显子2与3之间的剪切位点。其中基因突变多发生在密码子65、76、78和98，剪切突变则多发生在密码子155、158、161、162和167。临床两大类型间的VHL综合征，其VHL基因突变存在有明显的不同，I型主要表现为VHL基因的缺失、无义突变及移码突变，而Ⅱ型主要表现为VHL基因的错义突变。
[0005]由于VLH综合征受累器官多样性，且可同时或先后发病，间隔时间可长达10年以上，因此临床医生对诊断该疾病存在较大困难。而VHL基因检测是准确有效的诊断方法，特别对无症状的VHL病患者可以早期发现、早期治疗，减缓疾病进程，提高治疗效率。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一个检测VHL基因c.
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195G＞A位点突变的试剂盒，采用Touch
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down PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测患者体内VHL基因c.
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195G＞A位点的突变情况。所述检测VHL基因c.
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195G＞A位点突变的试剂盒，包括：扩增VHL基因c.
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195G＞A位点的引物，其碱基序列为：
[0007]VHL
‑
F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTATAGTGGAAATACAGTAACGAGT
[0008]VHL
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R:AACAGCTATGACCATGCGTGCTATCGTCCCTGCT。
[0009]进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
[0010]M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0011]M13 R：AACAGCTATGACCATG。
[0012]本专利技术还提供了检测VHL基因c.
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195G＞A位点突变情况的方法，包括以下步骤：
[0013](1)抽提外周血中的基因组DNA；
[0014](2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
[0015](3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
[0016](4)对测序结果进行判断，确定VHL基因c.
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195G＞A位点是否发生突变；
[0017]其中PCR扩增引物碱基序列为：
[0018]VHL
‑
F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTATAGTGGAAATACAGTAACGAGT
[0019]VHL
‑
R:AACAGCTATGACCATGCGTGCTATCGTCCCTGCT。
[0020]进一步地，测序引物碱基序列为：
[0021]M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0022]M13 R：AACAGCTATGACCATG。
[0023]本专利技术还提供了一种检测VHL基因c.
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195G＞A位点突变的试剂盒，包括
[0024](1)血液DNA抽提试剂；
[0025](2)检测体系PCR扩增反应液；
[0026](3)测序体系试剂；
[0027]其中PCR扩增反应液引物碱基序列为：
[0028]VHL
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F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTATAGTGGAAATACAGTAACGAGT
[0029]VHL
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R:AACAGCTATGACCATGCGTGCTATCGTCCCTGCT
[0030]测序引物碱基序列为：
[0031]M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0032]M13 R：AACAGCTATGACCATG。
[0033]有益效果：本专利技术设计了扩增VHL基因c.
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195G＞A位点的引物，采用Touch
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down PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本专利技术利用测序技术检测患者VHL基因c.
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195G＞A突变位点的方法，可以将VHL基因c.
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195G＞A位点的突变情况检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。
附图说明
[0034]图1为样本扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker DL 2000，1
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12为血液样本1至样本12，经PCR扩增后，引物扩增有效，且扩增目的产物条带清晰，产物大小正确。
[0035]图2为样本9检测VHL基因c.
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195G＞A位点的野生型测序截图结果。
[0036]图3为样本11检测VHL基因c.
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195G＞A位点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测VHL基因c.
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195G>A位点突变的引物，其特征在于，其碱基序列为：VHL
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F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTATAGTGGAAATACAGTAACGAGTVHL
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R:AACAGCTATGACCATGCGTGCTATCGTCCCTGCT。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13 R：AACAGCTATGACCATG。3.检测VHL基因c.
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195G>A位点突变的方法，包括以下步骤：(1)抽提外周血的基因组DNA；(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；(4)对测序结果进行判断，确定c.
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195G>A位点是否发生突变；其中，步骤(2)PCR扩增引物碱基序列为：VHL
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【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，牛林梅，
申请(专利权)人：济南艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：