一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法，涉及蛋白原核表达系统领域。本发明专利技术将热激后的感受态细胞直接与诱导剂混合，而后将二者的混合液涂布于含有抗生素的平板上，可以同时节省活化的时间和检测的时间，缩减了活化后再诱导的冗长步骤、SDS

【技术实现步骤摘要】
一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法


[0001]本专利技术涉及蛋白原核表达系统领域，具体而言，涉及一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法。

技术介绍

[0002]目前，筛选原核蛋白表达菌的方法是：在得到待转化质粒后，先将待转化质粒转入感受态细胞，培养，挑取单克隆菌斑，进一步活化、诱导目标蛋白的表达，细胞破碎后采用SDS
‑
PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测和/或Western blot(蛋白质印记法)验证等一系列实验过程。一般需要5
‑
7天，且尚不能保证目的蛋白有表达，需要重新挑斑、检测、验证等实验。若平板上没有目的菌斑，甚至需要重新转化，增加了工作量和时间成本。
[0003]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法以解决上述技术问题。
[0005]本专利技术是这样实现的：
[0006]本专利技术提供了一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其包括：将热激后的带有目标质粒的感受态细胞直接与诱导剂混合，混合后涂布于含有抗生素的平板上，培养，然后从平板上挑取多个单克隆菌落分别接种于无抗性培养基中，然后将无抗性培养基中的菌液进行细胞裂解，获得沉淀液，对沉淀液进行Dot blot分析以确定阳性菌斑。
[0007]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述平板上含抗生素的浓度为0.5
‰
～1
‰
。
[0008]在一种可选的实施方式中，感受态细胞与诱导剂的混合液涂布至含有抗生素的平板上的涂布体积为30
‑
100μL。可选地，将部分感受态细胞与诱导剂的混合液涂布至含有抗生素的平板上。
[0009]在本专利技术应用较佳的实施方式中，每100ul带有目标质粒的感受态细胞与终浓度为0.5mM
‑
2mM的诱导剂混合。
[0010]在一种可选的实施方式中，感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞。
[0011]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述诱导剂选自IPTG、TMG或ONPG。
[0012]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述对菌液进行细胞裂解获得沉淀液的方法包括：采用超声细胞破碎法、SDS法、溶菌酶法、热休克法或化学裂解液法使得菌液的细胞破碎，然后离心得到沉淀物，经缓冲液溶解沉淀后获得沉淀液。
[0013]在一种可选的实施方式中，缓冲液为8
‑
10M的尿素溶液。
[0014]在本专利技术应用较佳的实施方式中，取5
‑
30μL的菌液进行细胞裂解。
[0015]在一种可选的实施方式中，裂解是在0
‑
4℃下超声15
‑
20min，然后进行离心收集沉淀物。
[0016]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述对沉淀液进行Dot blot分析包括：将沉淀
液直接点在PVDF膜上，干燥后，进行封闭，依次与一抗和二抗孵育，曝光。
[0017]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述方法还包括：根据曝光的结果判断菌株是否表达目的蛋白。
[0018]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述一抗为小鼠抗6
×
His单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG。
[0019]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述曝光是采用ECL发光试剂盒或DAB显色试剂盒。
[0020]本专利技术具有以下有益效果：
[0021]本专利技术将热激后的感受态细胞直接与诱导剂混合，而后将二者的混合液涂布于含有抗生素的平板上，可以同时节省活化的时间和检测的时间，缩减了活化后再诱导的冗长步骤、SDS
‑
PAGE检测和Western blot等验证过程。通过改进诱导方法和筛选方法，采用Dot blot(斑点印记)可以快速实现多个单克隆菌落的鉴定，从而有助于更快速的获得原核蛋白表达的阳性菌。整个过程仅仅需要2
‑
3天，可以极大程度上缩减工作量以及实验周期，有利于节约科研人员的宝贵时间。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0023]图1为实施例1提供的快速筛选原核蛋白表达菌的方法的印迹实验结果图；
[0024]图2为实施例2提供的快速筛选原核蛋白表达菌的方法的印迹实验结果图；
[0025]图3为实施例3提供的快速筛选原核蛋白表达菌的方法的印迹实验结果图；
[0026]图4为对比例1提供的快速筛选原核蛋白表达菌的方法的印迹实验结果图；
[0027]图5实施例1筛选出的原核蛋白表达菌细胞裂解后的蛋白沉淀物进行WesternBlot验证结果图；
[0028]图6实施例2筛选出的原核蛋白表达菌细胞裂解后的蛋白沉淀物进行Western Blot验证结果图。
具体实施方式
[0029]现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0030]本专利技术提供了一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其包括：将热激后的带有目标质粒的感受态细胞直接与诱导剂混合，混合后涂布于含有抗生素的平板上，培养，然后从平板上挑取多个单克隆菌落分别接种于无抗性培养基中，然后将无抗性培养基中的菌液进行细胞裂解，获得沉淀液，对沉淀液进行Dot blot分析以确定阳性菌斑。
[0031]专利技术人发现，将热激后的感受态细胞直接与诱导剂混合，而后将二者的混合液涂
布于含有抗生素的平板上，可以同时节省活化的时间和检测的时间，缩减了活化后再诱导的冗长步骤、SDS
‑
PAGE检测和Western blot等验证过程。通过改进诱导方法和筛选方法，采用Dot blot(斑点印记)可以快速实现多个单克隆菌落的鉴定，从而有助于更快速的获得原核蛋白表达的阳性菌。整个过程仅仅需要2
‑
3天，可以极大程度上缩减工作量以及实验周期，有利于节约科研人员的宝贵时间。本专利技术筛选的阳性菌落可以用来完成后续的实验。
[0032]上述热激后的带有目标质粒的感受态细胞是指：感受态细胞融化后，加入目标质粒，冰上静置20
‑
30min后，40
‑
42℃热激40
‑
90s后置于冰上静置的感受态细胞。需要说明的是，热激步骤可根据感受态细胞的不同选择热激的条件。
[0033]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述平板上含抗生素的浓度为0.5
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，其包括：将热激后的带有目标质粒的感受态细胞直接与诱导剂混合，混合后涂布于含有抗生素的平板上，培养，然后从平板上挑取多个单克隆菌落分别接种于无抗性培养基中，然后将无抗性培养基中的菌液进行细胞裂解，获得沉淀液，对沉淀液进行Dot blot分析以确定阳性菌斑。2.根据权利要求1所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，所述平板上含抗生素的浓度为0.5
‰
～1
‰
；优选地，感受态细胞与诱导剂的混合液涂布至含有抗生素的平板上的涂布体积为30
‑
100μL。3.根据权利要求1所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，每100ul所述带有目标质粒的感受态细胞与终浓度为0.5mM
‑
2mM的所述诱导剂混合；优选地，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞。4.根据权利要求3所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，所述诱导剂选自IPTG、TMG、ONPG、阿拉伯糖、色氨酸或磷酸盐。5.根据权利要求1所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，对菌液进行细胞裂解获得沉淀液的方法包括：采用超...

【专利技术属性】
技术研发人员：付康，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：