一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，包括下述步骤：1）利用下述引物，以pGEX

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法


[0001]本专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，属于兽医学


技术介绍

[0002]非洲猪瘟病毒为线性双股DNA病毒，为非洲猪瘟病毒科的唯一成员，且是唯一已知的虫媒DNA病毒，能引起家猪和野猪感染的一种急性、烈性、高度接触的传染性疾病。急性型表现高热、出血斑，死亡率极高，可达到100％，其余类型出现精神沉郁、共济失调、呼吸困难等临床症状，给全球养猪业造成了巨大经济损失。I177L基因是新鉴定的非洲猪瘟毒力基因，位于ASFV基因组中间的稳定区，负责编码177个氨基酸，在病毒感染晚期表达。近年来研究发现敲除I177L 基因可以获得毒力减弱的毒株，家猪免疫后临床表现正常，并且对亲本毒株起到完全保护作用，不排毒。Borca Manuel V等又在ASFV
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G
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ΔI177L的基础上敲除了ASFV基因组中多基因家族(Multigene families,MGF)的八个基因，构建了衍生毒株ASFV
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G
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ΔI177L/ΔLVR克服了原毒株只能在原代猪巨噬细胞中复制的缺点，为商品化疫苗的开发提供了可能。然而，对于I177L蛋白的生物学功能和作用机制还不甚清楚，本专利技术对非洲猪瘟病毒I177L基因进行克隆的基础上，构建其原核表达载体pGEX
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I177L并实现高效表达，获得GST
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I177L融合蛋白，对该蛋白后续研究具有重要意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于针对上述存在的问题，提供一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，实现I177L蛋白的高效表达，为后续I177L蛋白生物学功能研究和基因缺失苗鉴别诊断试剂的开发提供条件。本专利技术的原理和最核心的技术是利用重组酶ExnaseTM II的同源重组克隆，构建I177L原核表达载体并实现 GST
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I177L融合蛋白的高效表达。
[0004]本专利技术的目的是这样实现的：一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，其特征在于，包括下述步骤：
[0005]1)利用下述引物，以pGEX
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6p
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1质粒为模板，PCR扩增出pGEX
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6p
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1线性化表达载体；
[0006]上游引物：5
‘
TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC 3
’
；
[0007]下游引物：5
‘
CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT 3
’
；
[0008]2)利用下述引物，以质粒pMD19T
‑
I177L为模板，PCR扩增出I177L原核表达片段；
[0009]上游引物：5
‘
GTTCCAGGGGCCCATGTATGAAATTATTTTG3
’
；
[0010]下游引物：5
‘
GTTTTCACCGTCATTAAAAGTAGATGAAC3
’
；
[0011]3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR扩增产物进行快速重组克隆，得到阳性克隆；阳性克隆经IPTG诱导后进行表达鉴定与纯化，获得纯化的I177L融合蛋白。
[0012]步骤3)中，阳性克隆转化到BL21细菌，经IPTG诱导获得GST
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I177L融合蛋白。
[0013]本专利技术方法先进科学，通过本专利技术，提供了一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达
载体的方法，其中，一种非洲猪瘟病毒I177L基因载体pGEX
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1，为现有研究中存在的多个问题提供可选择的条件。本专利技术公开了PCR扩增pGEX
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1 线性化载体引物以及PCR扩增非洲猪瘟病毒I177L基因引物序列。本专利技术还公开了一种基于重组酶ExnaseTM II并利用pGEX
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1线性化载体以及PCR扩增 I177L基因体外一步骤克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现I177L蛋白高效表达。
[0014]本专利技术的具体步骤为：
[0015](1)利用下述引物，以pGEX
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6p
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1质粒为模板，PCR扩增出pGEX
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6p
‑
1线性化表达载体；
[0016]上游引物：5
‘
TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC 3
’
；
[0017]下游引物：5
‘
CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT 3
’
；
[0018](2)利用下述引物，以质粒pMD19T
‑
I177L为模板，PCR扩增出I177L原核表达片段；
[0019]上游引物：5
‘
GTTCCAGGGGCCCATGTATGAAATTATTTTG3
’
；
[0020]下游引物：5
‘
GTTTTCACCGTCATTAAAAGTAGATGAAC3
’
。
[0021](3)利用重组酶ExnaseTM II将线性化载体pGEX
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1和I177L基因的PCR 扩增产物进行连接重组反应，得到阳性克隆，并转化到BL21细菌，经IPTG诱导可获得GST
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I177L融合蛋白。
[0022]本专利技术的有益效果为：
[0023]本专利技术设计的引物及基于重组酶ExnaseTM II的克隆策略，可不经酶切快速构建出非洲猪瘟病毒I177L基因的原核表达载体pGEX
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I177L，并以此原核表达载体实现非洲猪瘟病毒I177L高效表达及纯化融合蛋白，为深入研究I177L 生物学功能及基于ASFV
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G
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ΔI177L基因缺失苗鉴别诊断试剂的开发具有重要意义。
[0024]综上，本专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法。具体内容包括利用同源重组技术，将I177L基因克隆至线性化载体pGEX
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1中，转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，获得GST
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I177L的融合表达蛋白，并成功对融合蛋白进行纯化。本专利技术将获得非洲猪瘟I177L基因的表达载体，实现I177L 基因在大肠杆菌中的表达，获得纯化的GST
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I177L融合蛋白，表达载体构建和 I177L融合蛋白的纯化为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，其特征在于，包括下述步骤：1）利用下述引物，以pGEX
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1质粒为模板， PCR扩增出pGEX
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1线性化表达载体；上游引物：5
‘
TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC 3
’
；下游引物：5
‘
CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT 3
’
；2）利用下述引物，以质粒pMD19T
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I177L为模板，PCR扩增出I177L原核表...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆月馨，叶建强，尹雪凤，胡凤洁，徐小龙，谢菁，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：