蛋白硒纳米酶及其制备方法和用途技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了一种蛋白纳米酶及其制备方法和应用。该制备方法是将硒化合物和壳寡糖加入经过二硫键还原剂处理后的蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液中，在蛋白内部原位还原成单质纳米硒，集成蛋白内部N、S、O活性基团和过量巯基群，以及单质纳米硒和壳寡糖的阳离子聚合效应诱导组装，获得蛋白硒纳米酶，大大改善蛋白硒纳米酶在溶液中的分散和稳定性。实验表明，这种白蛋白纳米酶生物利用度大，安全性更高，可以很好的应用于制备抗皮肤衰老护肤品、防治酒精性肝损药物、消炎药物、止血药物、防治溃疡药物、创面修复药物或防治射线辐射损伤药物。物。

【技术实现步骤摘要】
蛋白硒纳米酶及其制备方法和用途


[0001]本专利技术属于生物医药
，特别涉及一种蛋白硒纳米酶及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]硒是人体必需微量元素，在生理活动中发挥着重要作用。硒具有抗氧化、调节免疫、拮抗有害重金属等重要生物功能。缺硒与40多种疾病相关，特别严重的如AIDS、乙型肝炎、肝癌、克山病、大骨节病、心脑血管疾病等。适当补硒则可以有效防控有关的疾病。关于正常人群的硒摄入量标准，世界卫生组织(WHO)规定为40～100μg/d，中国营养学会推荐为60～200μg/d，加拿大规定为98～224μg/d。世界上40多个国家和地区缺硒或低硒，中国约72％的地区，2/3的人口居住在低硒或缺硒地区。中国13省市的营养调查结果表明，成人每天的摄取硒仅为26μg，严重处于缺硒状态。因此，中国居民是普遍缺硒。目前为止，含硒无机物的典型代表为亚硒酸钠，其在空气中稳定，易溶于水，不溶于乙醇；国内外已有多家制药企业生产亚硒酸钠的片剂，用以治疗和预防属于地方病的克山病和大骨节病；硒酵母片用于低硒的肿瘤、肝病、心脑血管疾病病人或其他低硒引起的疾病；硒酵母锌片用于男性不孕不育，针对少精弱精，用于有效提高男性精子活跃度，预防前例腺炎。
[0003]然而，硒为一种微量有益元素，其有效性和安全性始终是需要平衡的第一大问题。食物来源或营养补充的硒化合物，不论是无机硒(亚硒酸钠(小鼠急性毒性LD
50
～10.7mg Se/kg，中毒剂量～1.0mg Se/kg)、硒酸钠)，还是有机硒(酵母硒(小鼠急性毒性LD
50
～37.37mg Se/kg)、硒代蛋氨酸(小鼠急性毒性LD
50
～25.6mg Se/kg，中毒剂量～3.0mg Se/kg)、富硒菌(小鼠急性毒性LD
50
～18.94mg Se/kg)、硒代半胱氨酸(小鼠急性毒性LD
50
～14.6mg Se/kg)，在人类体内的安全剂量范围非常狭窄，硒的日营养推荐摄入量为60μg，每日摄取硒的量达到200～300μg时，具有癌症预防作用；然而每日摄入硒剂量等于或高于819
±
126μg Se时，敏感病人则表现硒中毒现象。目前限定硒最高日摄入量为400～500μg。因此，补硒很容易因过量而产生毒性，这限制了传统硒化合物在临床疾病防治方面的广泛应用。
[0004]近年来，具有成本低，易于修饰，稳定性好等优点的纳米酶是一种具有高效活性的人工酶。与天然生物酶相比，纳米酶具有催化效率高、效果稳定、性价比高和可宏量制备等的优点。除催化底物产生自由基用于化学动力学治疗的过氧化物纳米酶在肿瘤治疗上受到广泛关注之外，纳米酶在医药、化工、食品、农业和环境等领域具有广泛的应用潜质。因此，研发新型的纳米酶具有非常重要的科学意义和实际应用价值。
[0005]前期研究发现，纳米硒颗粒具有清除自由基和超氧根的类人工酶性质，但尚未见到白蛋白硒纳米酶的绿色制备及其抗皮肤衰老、镇痛、酒精性肝损、消炎、止血、溃疡、创面修复和减少辐射损伤的新功能研究，构建新型硒纳米酶有助于推动硒纳米药物的临床应用。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中存在的硒元素有效剂量和安全性窄等缺点和不足，本专利技术的首要目的在于提供一种蛋白硒纳米酶的制备方法，该方法操作简单，将硒化合物和壳寡糖(壳聚寡糖、低聚壳聚糖，聚合度在2～20之间寡糖，分子量小于4000)加入还原型蛋白溶液中，集成还原蛋白内部过量巯基群、壳寡糖的阳离子聚合效应组装及硒化合物离子在白蛋白内部被还原，获得尺寸均一，分散性好，保存温度宽，保存时间长及在体液中具有良好稳定性的新型蛋白硒纳米酶，改善其在溶液中的分散和稳定性。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的蛋白硒纳米酶。
[0008]本专利技术的再一目的在于提供一种上述蛋白硒纳米酶的用途。
[0009]本专利技术的目的通过下述技术方案来实现：
[0010]一种蛋白硒纳米酶的制备方法，将硒化合物和壳寡糖加入经过二硫键还原剂处理后的蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液中，在蛋白内部原位还原成单质纳米硒，集成蛋白内部N、S、O活性基团和过量巯基群，以及单质纳米硒和壳寡糖的阳离子聚合效应诱导组装，获得蛋白硒纳米酶。
[0011]所述二硫键还原剂为还原型谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、β
‑
巯基乙醇(β
‑
Mercaptoethanol，β
‑
ME)或三(2
‑
羧乙基)膦(Tris(2
‑
carboxyethyl)phosphine，TCEP)；
[0012]所述白蛋白为含二硫键的蛋白，包括天然来源或工程化重组得到的人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、驴血清白蛋白、转铁蛋白中的一种以上；
[0013]所述硒化合物为二氧化硒、亚硒酸盐或硒酸盐。
[0014]上述的制备方法，具体包括如下步骤：
[0015]A、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液；
[0016]B、将白蛋白加入二硫键还原剂溶液中，置入密封或除氧的瓶中，搅拌均匀，在33～60℃反应10～300min，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液；
[0017]C、向步骤B所得白蛋白溶液中加入步骤A所得复合溶液，得到白蛋白终浓度为0.01～100mg/mL的反应液，4～24℃密封条件下进行搅拌反应1～12h，再经过透析，得到蛋白硒纳米酶溶液。
[0018]步骤A所述壳寡糖在复合溶液中质量浓度为0.1～0.5％，所述硒化合物在复合溶液中浓度为1～10mM。
[0019]步骤B所述二硫键还原剂溶液是指二硫键还原剂的磷酸盐或生理盐水溶液，pH值为5.0～9.0，其浓度为0.01～60mM，优选为0.1～40mM；所述白蛋白在还原型白蛋白溶液中的浓度为0.01～200mg/mL。
[0020]步骤B所述反应是在37～50℃条件下反应30～200min。
[0021]步骤C所述透析是将溶液放入透析袋，并于0～30℃的磷酸缓冲溶液或生理盐水中透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物；透析分子截留不低于1000；所述白蛋白终浓度为20～60mg/mL。
[0022]一种由上述的制备方法制备得到的蛋白硒纳米酶。
[0023]所述蛋白硒纳米酶的粒径分布范围为10～200nm，优选为10～150nm；蛋白硒纳米
酶中的硒：壳寡糖：白蛋白的摩尔比为1：(1～40)：(1/30～1)，优选地，硒：壳寡糖：白蛋白的摩尔比为1：(2～20)：(1/20～2)。
[0024]所述蛋白硒纳米酶在低温和常温情况下，在溶液中和各种体液中均可稳定存在。
[0025]上述的蛋白硒纳米酶在制备抗皮肤衰老护肤品、防治酒精性肝损药本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白硒纳米酶的制备方法，其特征在于：将硒化合物和壳寡糖加入经过二硫键还原剂处理后的蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液中，在蛋白内部原位还原成单质纳米硒，集成蛋白内部N、S、O活性基团和过量巯基群，以及单质纳米硒和壳寡糖的阳离子聚合效应诱导组装，获得蛋白硒纳米酶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述二硫键还原剂为还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、二硫苏糖醇、β
‑
巯基乙醇或三(2
‑
羧乙基)膦；所述白蛋白为含二硫键的蛋白，包括天然来源或工程化重组得到的人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、驴血清白蛋白、转铁蛋白中的一种以上；所述硒化合物为二氧化硒、亚硒酸盐或硒酸盐。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：A、将壳寡糖溶于水溶液，再加入硒化合物，制备得到硒化合物和壳寡聚糖的复合溶液；B、将白蛋白加入二硫键还原剂溶液中，置入密封或除氧的瓶中，搅拌均匀，在33～60℃反应10～300min，得到蛋白内部空间结构打开的富含巯基群的还原型白蛋白溶液；C、向步骤B所得白蛋白溶液中加入步骤A所得复合溶液，得到白蛋白终浓度为0.01～100mg/mL的反应液，4～24℃密封条件下进行搅拌反应1...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭咏波，王军懿，曾雅君，于超，彭琪瑶，樊鑫垚，张雅真，杨丽梅，谢丽雲，罗权，杨腾，罗爱民，
申请(专利权)人：彭咏波，
类型：发明
国别省市：