人端粒长度检测试剂盒及非诊断目的的检测方法技术

本发明专利技术提供一种非诊断目的的人端粒相对长度检测方法，包括：提取待测样本基因组DNA，对待测样本基因组DNA和来自不少于3000个人的全血DNA混样标准品分别利用MMQPCR方法进行检测，并通过PCR反应收集T、S信号，基于标准曲线和待测样本基因组DNA的T/S比值计算得到待测样本的人端粒相对长度；PCR反应中以白蛋白基因作为内参基因并使用合适的引物，控制每10μL反应体系中含有10μM的telg引物0.36μL、10μM的telc引物0.36μL、10μM的albu引物0.06μL、10μM的albd引物0.06μL和1μL的待测样本DNA或标准品DNA。本发明专利技术还提供用于检测人端粒长度的试剂盒。本发明专利技术的检测方法和试剂盒检测准确性高、操作简便、需样量低，适用于大样本量的人群检测。量的人群检测。

【技术实现步骤摘要】
人端粒长度检测试剂盒及非诊断目的的检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学和医学检测
，特别涉及一种人端粒相对长度检测试用试剂盒，及利用该试剂盒检测人端粒长度的非诊断目的的检测方法。

技术介绍

[0002]目前，测定端粒长度的实验方法多种多样。其中，Southern Blot技术虽然是端粒长度测定领域的“金标准”，但由于该方法样本量需求大、操作复杂、实验繁琐、对实验员的技术要求较高；PCR定量法因操作便捷、测定时间短，可广泛应用于人群研究，但是大部分研究采用的是分别定量单拷贝基因和端粒基因，然后根据2
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ΔΔCT
相对定量的方式来表示端粒相对长度；或者测定端粒(T)信号在一组反应、同一样本、但不同反应孔中单拷贝基因(S)信号，根据T/S比值与平均端粒长度成正比来达到定量的目的。
[0003]为了降低不同反应孔多次移液加样带来的系统误差，已有学者提出了改进的荧光定量PCR检测方法，在一组反应、同一反应孔中同时收集端粒(T)信号和单拷贝基因(S)信号。
[0004]即便如此，利用现有的荧光定量PCR检测端粒长度时，检测结果准确性仍然有待提高。因此有必要从多个方面优化用于检测端粒长度的荧光定量PCR方案，以显著提升其检测准确性。

技术实现思路

[0005]鉴于上述背景，本专利技术一方面的目的在于：提供一种优化的用于人端粒长度检测的荧光定量PCR检测方法。
[0006]本专利技术另一方面的目的在于：提供一种可以用于本专利技术上述人端粒长度检测方法的试剂盒。
[0007]本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：
[0008]首先，提供一种非诊断目的的人端粒相对长度检测方法，包括：提取待测样本基因组DNA，以来自不少于3000个人的全血DNA混合样品作为标准品，待测样本基因组DNA和标准品分别利用单色多重荧光定量PCR(MMQPCR)方法进行检测，并通过PCR反应收集端粒荧光信号(T)和单拷贝基因荧光信号(S)；其中，标准品以涵盖所述待测样本基因组DNA浓度的标准系列浓度进行检测，得到T/S比值标准曲线，基于所述标准曲线和待测样本基因组DNA检测得到的T/S比值计算得到待测样本的人端粒相对长度；
[0009]其中，MMQPCR方法检测的单拷贝基因为白蛋白(ALB)基因，作为内参基因；所述的PCR反应使用的引物序列如下：
[0010][0011]本专利技术所述的检测方法中，所述标准品的标准系列浓度来自一个可涵盖所述待测样本基因组DNA浓度的浓度值范围，例如，该浓度值范围可以是从待测样本基因组DNA浓度的0.0625倍到10倍。检测时可以将所述标准品配制成该范围中相对均匀分布的一系列具体浓度，这一系列具体浓度中可以包含或不包含所述待测样本基因组DNA浓度；优选的方案中，为了提高标准曲线的参考性，所述的标准品的标准系列浓度取值由不少于5个数的等比数列构成，且大于和小于所述待测样本基因组DNA浓度的数值均不少于2个。
[0012]本专利技术优选的所述检测方法中，在所述的PCR反应中，将待测样本基因组DNA和不同浓度的标准品分别与扩增反应试剂混合形成反应体系进行扩增反应；其中，按体积百分比计，待测样本基因组DNA和标准品加入量占所述反应体系的5％～10％；所述的扩增反应试剂包括实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料、端粒基因引物(telg、telc)、内参基因引物(albu、albd)及无菌无酶水；并控制每10μL的所述反应体系中含有10μM的telg引物0.36μL、10μM的telc引物0.36μL、10μM的albu引物0.06μL、10μM的albd引物0.06μL、1μL的待测样本DNA或标准品DNA。
[0013]本专利技术优选的检测方法中，所述的PCR反应程序设置如下：
[0014]Stage 1(hold stage)：1cycle：94℃15min；
[0015]Stage 2(PCR stage1)：2cycle：94℃15s；49℃15s；
[0016]Stage 3(PCR stage2)：40cycle:94℃15s；62℃10s；74℃30s
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收集荧光(tel)；84℃10s；88℃30s
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收集荧光(alb)。
[0017]本专利技术优选的检测方法中，所述的标准品来源的人群年龄跨度为20～50岁。
[0018]此外，本专利技术还提供一种用于检测人端粒长度的试剂盒，其中的试剂由标准品、引物、实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料和无菌无酶水组成；所述的标准品是来自不少于3000个人的全血DNA混合样品；所述的引物由第一引物、第二引物、第三引物和第四引物组成；所述的第一引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的端粒基因的上游引物，所述的第二引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的端粒基因的下游引物，所述的第三引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的单拷贝基因(白蛋白)的上游引物，所述的第四引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的单拷贝基因(白蛋白)的下游引物；所述的第一引物和第二引物的体积相同，均为所述第三引物或第四引物体积的至少6倍。
[0019]本专利技术优选的试剂盒中，所述的实时定量PCR扩增的预混合溶液是内含反应缓冲
液、GreenⅠ、dNTPs、Mg
2+
、rTaq DNA聚合酶及抗DNA聚合酶抗体的2
×
预混液。
[0020]本专利技术优选的试剂盒中，所述的参比染料是50
×
ROX reference dye。
[0021]本专利技术优选的试剂盒中，所述的实时定量PCR扩增的预混合溶液体积是所述的参比染料体积的至少500倍，优选900倍。
[0022]本专利技术所述的试剂盒用于人端粒长度检测时，可先根据待测样本DNA的浓度将所述标准品稀释配置成一系列浓度的标准品试剂，形成标准系列浓度梯度，使待测样本DNA的浓度包含于标准系列浓度梯度涵盖的范围内，然后根据既定的加样量将四种引物、实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料及无菌无酶水与各浓度的标准品和待测样本分别混合形成扩增反应体系，进行PCR反应。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的人端粒长度检测方法具有以下几方面有益效果：
[0024]1.标准品出峰稳定
[0025]标准品端粒和单拷贝基因(白蛋白)的标准系列出峰稳定，熔解曲线光滑，凝胶电泳条带图中无明显非特异性扩增产物。
[0026]2.选择了更稳定的单拷贝基因并设计了合适的引物，显著改善了MMQPCR的荧光收集效果。
[0027]与现有技术中其他利用荧光定量PCR的端粒长度检测方法相比，本专利技术中选择的内参基因ALB是稳定性更高的单拷贝基因。在此基础上，本专利技术使用的单拷贝基因ALB的引物序列比常规引物增加了富含GC
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clamp的序列，能够显著提高单色多重荧光定量PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的人端粒相对长度检测方法，包括：提取待测样本基因组DNA，对待测样本基因组DNA和标准品分别利用单色多重荧光定量PCR(MMQPCR)方法进行检测，并通过PCR反应收集端粒荧光信号(T)和单拷贝基因荧光信号(S)；其特征在于：所述的标准品是来自不少于3000个人的全血DNA混合样品；将所述的标准品以涵盖所述待测样本基因组DNA浓度的标准系列浓度进行检测，得到T/S比值标准曲线，基于所述标准曲线和待测样本基因组DNA检测得到的T/S比值计算得到待测样本的人端粒相对长度；其中，MMQPCR方法检测的单拷贝基因为白蛋白(ALB)基因，作为内参基因；所述的PCR反应使用的引物序列如下：在所述的PCR反应中，将待测样本基因组DNA和不同浓度的标准品分别与扩增反应试剂混合形成反应体系进行扩增反应；其中，按体积百分比计，待测样本基因组DNA和标准品加入量分别占所述反应体系的5％～10％；所述的扩增反应试剂包括实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料、端粒基因引物(telg、telc)、内参基因引物(albu、albd)及无菌无酶水；并控制每10μL的所述反应体系中含有10μM的telg引物0.36μL、10μM的telc引物0.36μL、10μM的albu引物0.06μL、10μM的albd引物0.06μL、1μL的待测样本DNA或标准品。2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述涵盖所述待测样本基因组DNA浓度的标准系列浓度处于待测样本基因组DNA浓度的0.0625倍到10倍之间。3.权利要求1或2任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述的标准系列浓度取值由不少于5个数的等比数列构成，且大于和小于所述待测样本基因组DNA浓度的数值均不少于2个。4.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR反应程序设置如下：Stage 1(hold stage)：1cycle：94℃15min；Sta...

【专利技术属性】
技术研发人员：段化伟，王婷，王艳华，林杨，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，
类型：发明
国别省市：