花青素生物合成的组合物和方法技术

本发明专利技术公开了花青素生物合成的组合物和方法。本发明专利技术利用植物花青素生物合成途径中的酶类基因DFR、LDOX、UFGT构建了花青素生物合成的载体以及含有该载体的宿主细胞，并将所述载体及宿主细胞用于花青素生物合成，为现有技术提供了一种不同的花青素生物合成方法。进一步地，通过DFR的不同底物的添加，本领域技术人员可获得不同颜色的花青素。可获得不同颜色的花青素。可获得不同颜色的花青素。

【技术实现步骤摘要】
花青素生物合成的组合物和方法


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及利用植物愈伤细胞进行花青素生物合成的组合物和方法。

技术介绍

[0002]花青素是一类在植物中广泛存在的次级代谢产物，属于黄酮类物质。花青素赋予植物缤纷的色彩，在植物发育过程中，具有使植物免受紫外辐射、抗病原菌侵染等重要生理作用。同时，花青素在治疗心脏病和癌症，清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面具有重要疗效。因其呈色性能好、健康、安全，已被广泛地应用于食品、化妆品和医药等各个行业，更是植物界研究的热点领域。
[0003]目前，花青素的制备有多种方法。由于花青素广泛存在于苹果、葡萄、玉米、蓝莓和拟南芥等植物中，最直接的方式是通过物理或化学手段从植物中提取花青素。Blackhall等从新鲜的樱桃中提取花青素，确定了最佳的提取时间和温度分别为90min和37℃，使用100％酸化溶剂按液固比10:1(mL：g)进行提取时，得到的花青素产率最高(Blackhall ML,Berry R,Davies NW,Walls JT.Optimized extraction of anthocyanins from Reid Fruits'Prunus avium'Lapins'cherries.Food Chem.2018Aug 1；256:280
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285.)虽然从植物中可以提取得到花青素，但是直接提取受到季节、地域和植物生长的限制，如果需要用于大规模生产还要考虑其他的获取方式。
[0004]随着近几年的深入研究，逐渐明确了花青素在植物中的合成途径并确定了花青素合成的关键酶基因，这使得通过微生物合成的方式获得花青素成为可能，Solopova等使用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)作为新型宿主，以绿茶为底物生产具有高价值的花青素，结果表明除了预期的红紫色化合物——矢车菊色素和飞燕草色素外，由乳酸乳球菌以绿茶为底物产生了具有甲基化的橙色和黄色吡喃花青素(Solopova A,Tilburg A,Foito A,et al.Engineering Lactococcus lactis for the production of unusual anthocyanins using tea as substrate[J].Metabolic Engineering,2019,54:160
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169.)。利用微生物合成花青素解决了从植物中提取的诸多限制，但花青素在微生物中的合成通路、产量、有害副产物等问题仍需做进一步研究。
[0005]相较之下，通过植物细胞培养来生产花青素具有生产周期短、受自然环境影响小、目标物易于提取和纯化、天然无污染等优点。赵文佳通过试验选出了一株独特、新颖的青钱柳红色愈伤系，研究了其形态、生长和代谢方面的特性，并建立了红色细胞悬浮培养体系，用于花青素的生产(赵文佳.利青钱柳红色愈伤组织的诱导和筛选及细胞悬浮培养生产花青素[D].江西农业大学,2020.)。中国专利CN 107142276B公开了一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，通过在作物中转入包含6个表达结构蛋白的基因和2个表达转录因子的基因组合，获得种子胚乳为紫色的、合成花青素的转基因作物。中国专利CN105039360B公开了柑橘八氢番茄红素合成酶基因用于提高草莓花青素含量以及利用所述柑橘八氢番茄红素合成酶基因提高草莓花青素含量的方法。但现有技术中，仍然缺少可
控性强、操作简单、纯度高的花青素生物合成方法。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了花青素生物合成的组合物和方法。
[0007]本专利技术利用植物花青素生物合成途径中的部分酶来构建高效的表达载体，将花青素合成所需的酶基因转入水稻愈伤组织中，通过植物愈伤细胞的培养获得花青素。
[0008]图1是植物中常见花色素苷生物合成途径(刘娟,冯群芳,张杰.二氢黄酮醇4
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还原酶基因(DFR)与花色的修饰[J].植物生理学报,2005,41(006):715
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719.)，该途径内的不同酶类具有一定的时空表达特异性。经过多次试验证明，向植物中转入合成途径中的酶类DFR、ANS、3GT可能是本专利技术中较好的花青素生物合成路线选择。其中虚线方框内的路径为葡萄中花青素的合成路径，葡萄中与上述酶类对应的基因为：DFR、LODX、UFGT。
[0009]植物中花色素种类繁多，提供了各种颜色的选择空间，图1中，经过DFR催化的三种不同的反应底物二氢杨梅黄酮(DHM)、二氢槲皮素(DHQ)或二氢堪非醇(DHK)使愈伤组织最终呈现不同的颜色。本领域技术人员可根据野生型植物愈伤组织的本底颜色，选择不同的DFR催化底物，以获得不同颜色的花青素。
[0010]在一方面，本专利技术提供一种花青素生物合成的载体，所述载体包含DFR、LDOX、UFGT基因，所述DFR的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDOX的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述UFGT的的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]根据密码子的简并性，针对某一基因，本领域技术人员可以设计出多种可编码该基因的序列。本领域技术人员可根据转基因植物的密码子偏好性对某一基因序列进行优化。在某些实施方式中，为实现DFR、LDOX、UFGT基因在植物花青素合成途径中的作用，其编码序列分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所记载的序列至少具有大约60％的相似性、大约65％的相似性、大约70％的相似性、大约75％的相似性、大约80％的相似性、大约85％的相似性、大约90％的相似性或大约95％的相似性、大约96％的相似性、大约97％的相似性、大约98％的相似性、大约99％的相似性。
[0012]在某些实施方式中，所述载体还包括其他标记基因，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。
[0013]在某些实施方式中，所述载体可用于双子叶植物或单子叶植物的花青素生物合成。优选的植物物种包括：烟草、水稻等，特别优选的植物物种为水稻。在某些实施方式中，所述植物为水稻。
[0014]在另一方面，本专利技术提供一种含有所述花青素生物合成载体的宿主细胞，宿主细胞可选自大肠杆菌、农杆菌、植物细胞等可供所述载体复制或表达的细胞。
[0015]在某些实施方式中，所述的DFR、LDOX、UFGT基因可以分别位于2个或3个载体中，也可以位于同一个载体中，包含DFR、LDOX、UFGT基因的载体共存于所述宿主细胞中。在某些实施方式中，DFR、LDOX、UFGT基因分别位于2个不同载体中。
[0016]在某些实施方式中，所述宿主细胞用于双子叶植物或单子叶植物的花青素生物合成。在某些实施方式中，所述植物为水稻。
[0017]在另一方面，本专利技术提供一种花青素生物合成的方法，所述方法包括以下步骤：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.花青素生物合成的载体，所述载体包含DFR、LDOX、UFGT基因，所述DFR的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDOX的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述UFGT的的基因序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的载体，还包括其他标记基因。3.如权利要求2所述的载体，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。4.包含权利要求1
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3所述任一载体的宿主细胞。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于：所述的DFR、LDOX、UFGT基因可以分别位于2个或3个载体中，也可以位于同一个载体中。6.花青素生物合成的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）构建含有如权利要求1所述的DFR、LDOX、UFGT基因的载体；2）将步骤1）构建的载体转入植物愈伤组织中，获得含有DFR、LDOX、UFGT的愈伤组织；3）添加DFR基因编码的酶的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王益行，吕晓荣，宋淼泉，凌建群，
申请(专利权)人：江苏吉锐生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：