一种单细胞蛋白数字化成像检测方法技术

本发明专利技术公开了单细胞蛋白数字化成像检测方法，涉及蛋白质检测领域，本发明专利技术通过使用设计好的菲林掩膜版制备芯片模板，合成蛋白质固定凝胶光敏剂，配合芯片模板制备具有光敏感型蛋白质固定凝胶的蛋白质印迹芯片，加入样品后，根据单细胞免疫印迹(scWB)程序进行电泳，并通过UV交联固定蛋白质，使用标记抗体进行目标蛋白免疫印迹检测，观察分析结果。本发明专利技术是一种能够高通量、时间短、能够稳定保存数据和数字化处理检测结果、便携小巧、功能稳定且成本低的单细胞蛋白质检测手段。本低的单细胞蛋白质检测手段。本低的单细胞蛋白质检测手段。

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞蛋白数字化成像检测方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质检测领域，尤其涉及一种单细胞蛋白数字化成像检测方法。

技术介绍

[0002]稀有细胞的蛋白质分析已经越来越成为研究的重点。但受限于取样技术，富集技 术又或者机体本身该种细胞的含量极低，现有的技术手段很难对其进行系统的蛋白质 检测。稀有细胞目前研究最多的是循环肿瘤细胞，受精卵以及神经元细胞，他们分别 对疾病，发育以及早期认知的形成有重要作用，如果能对稀有细胞中数十种甚至数百 中蛋白水平进行描绘，则对于推动发育生物学，肿瘤免疫等领域有重要作用。
[0003]现有的蛋白检测技术，可分为非标记检测与有标记的检测两大类。非标记蛋白检 测重点在于发现未知蛋白，定义新的蛋白功能。非标记检测主要为质谱分析，分析样 本为肽段。质谱技术具有较好的灵敏度、准确度，能准确测定蛋白质。目前质谱主要 测定蛋白质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，在对 蛋白质结构分析的研究中占据了重要的地位。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分 析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单细胞蛋白数字化成像检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、使用设计好的菲林掩膜版制备芯片模板；步骤2、制备蛋白质固定凝胶光敏剂；步骤3、使用步骤2中的蛋白质固定凝胶光敏剂制备光敏感型蛋白质固定凝胶液，并配合步骤1中的芯片模板制备单细胞蛋白质印迹芯片，所述蛋白质印迹芯片由于芯片模板的形状而形成多个微孔；制备裂解液，裂解液同时也是电泳缓冲液；步骤4、向步骤3中制备的蛋白质印迹芯片内加载待测样品；步骤5、根据单细胞免疫印迹(scWB)程序对加载了待测样品的蛋白质印迹芯片进行电泳，电泳后，立即通过UV交联固定蛋白质，波长为300
‑
370nm强度为40J/cm2，交联时间为15秒
‑
10分钟；步骤6、使用标记抗体进行目标蛋白免疫印迹检测，观察分析结果。2.如权利要求1所述的一种单细胞蛋白数字化成像检测方法，其特征在于，所述步骤1还包括：步骤1.1、将一面涂有SU8
‑
2050凝胶的硅晶片在热板上于65℃烘烤1分钟，然后在95℃的温度下烘烤8分钟；步骤1.2、将硅晶片放在曝光机上曝光进行4分钟UV曝光，UV波长365nm，强度30mW/cm2；步骤1.3、将步骤1.2中曝光完成后的硅晶片在热板上于65℃烘烤2分钟，然后在95℃下烘烤7分钟；步骤1.4、在硅晶片的第一层SU8
‑
2050凝胶层上涂覆第二层SU8
‑
2050凝胶进行均质，然后在热板上于65℃烘烤1分钟，然后在95℃温度下烘烤2分钟；步骤1.5、将设计好的胶片掩膜贴在硅晶片上，然后放入曝光机中进行4分钟UV曝光，UV波长365nm，强度30mW/cm2；步骤1.6、将步骤1.5中曝光完成后的硅晶片在热板上于65℃下烘烤2分钟，然后在95℃下烘烤7分钟，制成芯片模板；步骤1.7、用镊子固定芯片模板，并用显影液冲洗2
‑
3分钟；步骤1.8、用异丙醇，丙酮，乙醇和去离子水清洁芯片模板，然后在65℃下干燥。3.如权利要求1所述的一种单细胞蛋白数字化成像检测方法，其特征在于，步骤2中的所述蛋白质固定凝胶光敏剂为N
‑
(3
‑
甲基丙烯酰胺基丙基)
‑2‑
(1
‑
甲基
‑
1H
‑
吡咯
‑2‑
基)
‑
2H
‑
四唑
‑5‑
甲酰胺，即MAP
‑
mPyTC，所述MAP
‑
mPyTC的制备方法如下：步骤2.1、制备2
‑
(1
‑
甲基
‑
1H
‑
吡咯
‑2‑
基)
‑
2H
‑
四唑
‑5‑
羧酸乙酯：步骤2.1.1、溶解5g即12.5mmol的甲基
‑
1氢
‑
吡咯于30mL三氟乙醇；步骤2.1.2、在
‑
40℃下，向步骤2.1.1中溶液加入20g即62.5mmol二乙酸碘苯，在氮气保护下，于
‑
40℃搅拌2小时；步骤2.1.3、将步骤2.1.2产物浓缩至黑色油状，溶解于二氯甲烷；步骤2.1.4、在步骤2.1.3中溶液加入3g即21.6mmol 5
‑
甲酸乙酯四氮唑、3.1g即8.6mmol三氟甲烷磺酸铜(II)和16ml即108mmol三乙胺，在氮气保护下，室温搅拌24小时，进行反应；步骤2.1.5、反应结束后，用饱和氯化铵洗涤产物，无水硫酸镁干燥，再过滤干燥；步骤2.1.6、用硅胶快速层析进一步纯化产物，其中硅胶快速层析的洗脱剂为体积比
PE:EA＝5:1，得到棕色油状产物I，产物I即为2
‑
(1
‑
甲基
‑
1H
‑
吡咯
‑2‑
基)
‑
2H
‑
四唑
‑5‑
羧酸乙酯，结构式如式I所示：步骤2.2、制备2
‑
(1
‑
甲基
‑
1H
‑
吡咯
‑2‑
基)
‑
2H
‑
四唑
‑5‑
羧酸；步骤2.2.1、溶解步骤2.1中450mg即2mmol产物I于体积比为MeOH：H2O＝1:1的混合液共20ml中；步骤2.2.2、于0℃下，向步骤2.2.1中溶液加入850mg即10mmol氢氧化锂；步骤2.2.3、将步骤2.2.2中混合物置于室温，在氮气保护下，搅拌反应2小时；步骤2.2.4、反应结束后，在0℃下，加入2N HCL，调节pH为4
‑
5；步骤2.2.5、用98％的乙酸乙酯溶液萃取，并用饱和氯化铵洗涤混合有机相，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩为棕色固体产物II，即为2
‑
(1
‑
甲基
‑
1H
‑
吡咯
‑2‑
基)
‑
2H
‑
四唑
‑5‑
羧酸，结构式如式II所示：步骤2.3、制备N
‑
(3
‑
甲基丙烯酰胺基丙基)
‑2‑
(1
‑
甲基
‑
1H
‑
吡咯
‑2‑
基)
‑
2H
‑
四唑
‑5‑
甲酰胺；步骤2.3.1、将370mg即1.67mmol N
‑
(3
‑
氨基丙基)甲基丙烯酸盐
·
盐酸盐溶解于20mL四氢呋喃中；步骤2.3.2、在0℃下，向步骤2.3.1中溶液加入650mg即3.34mmol 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺
·
盐酸盐，即EDCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁显廷，谢海洋，李山鹤，丁屹，朱大为，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：