基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，包括：取核酸适配体功能化的纳米富集磁珠作为捕获探针，捕获反应体系中存在靶细菌，进行孵育后通过磁分离器回收磁珠适配体

【技术实现步骤摘要】
基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法


[0001]本专利技术涉及一种基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157： H7的方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，也称之为大肠杆菌，是人和动物肠道中最主要、 数量最多的细菌，属于革兰氏阴性菌。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛 抗原(H)和表面抗原(K)，后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大 肠杆菌分为150多型，绝大多数的大肠杆菌是不具有致病性的，而少部分的大肠杆菌却能够 引起胃肠道、泌尿系统或中枢神经系统的疾病，称为致病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichia coli，EPEC)。其中最具代表性的就是代号为O157:H7的大肠杆菌，它是EHEC(肠 出血性大肠杆菌)家族中的一员。O157:H7感染后的主要症状正是出血性腹泻，严重者可伴发 溶血尿毒综合征，危及生命。由于O157:H7危害较大，且可经食物和饮用水在人群中广泛传 播，O157:H7被列为常规检测项目。
[0003]现在用于大肠埃希氏菌检测的常规方法包括选择性培养方法、以分子生物学为基础的检 测方法、免疫学检测方法和近年来兴起的生物传感器检测技术等。虽然这些方法是当前最基 础和常见的检测方法，但是各自存在不足之处，比如操作过程复杂、耗费时间较长、灵敏度 和特异性不高、重复性较差等，因此建立高效快速检测方法是有效预防大肠杆菌病、保障公 共卫生安全的必要基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种基于核酸适配体、纳米粒 子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，将功能化量子点应用于食品中 E.coli O157:H7检测，结合核酸适配体功能化磁珠富集方法，优化食品中E.coli O157:H7检测 条件，最终建立E.coli O157:H7高效快速检测方法。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食 源性肠道致病菌O157：H7的方法，包括：
[0006]以E.coli O157:H7为靶标，经过多轮筛选富集，获得特异性结合E.coli O157:H7的核酸 适配体；
[0007]对所构建的A5适配体进行生物素修饰，通过链酶亲和素和生物素之间的结合反应，获 得核酸适配体功能化的纳米富集磁珠；
[0008]对所构建的A4适配体进行量子点修饰，通过共价修饰制备得到核酸适配体功能化的量 子点；
[0009]取核酸适配体功能化的纳米富集磁珠作为捕获探针，捕获反应体系中存在靶细菌，进行 孵育后通过磁分离器回收磁珠适配体
‑
靶细菌；然后向其中加入核酸适配体功能
化的量子点， 进行孵育结合；在磁场作用下富集磁珠，将沉淀重悬于缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧 光强度，根据荧光强度确定食源性肠道致病菌O157：H7的菌落总数。
[0010]进一步地，所述A5适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]进一步地，所述A4适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]进一步地，所述核酸适配体功能化的纳米富集磁珠的制备方法为：
[0013]采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子；
[0014]将Fe3O4磁性纳米粒子分散于乙醇水溶液中，超声混合，加入氨丙基三乙氧基硅烷，机 械搅拌并充入氮气保护，室温反应7～10h，然后用磁铁进行磁分离，清洗、干燥后得到氨基 功能化的Fe3O4磁性纳米粒子；
[0015]基于戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠；
[0016]在A5核酸适配体的5
’
端进行生物素标记得到功能化的核酸适配体；
[0017]将亲和素化氨基磁珠和功能化的核酸适配体混合，得到核酸适配体功能化的纳米富集磁 珠。
[0018]进一步地，所述共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子的步骤如下：将浓度为0.12mol/L FeSO4·
7H2O和浓度为0.2mol/L FeCl3·
6H2O溶于去离子水溶液中，机械搅拌混合，并且通入 氮气，充分去除溶液中的溶解氧后，逐滴加入浓度为2.5mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液pH 达到11，在室温下1000rpm剧烈搅拌30min，水解产生的Fe3O4磁性纳米粒子以磁铁分离， 分别用蒸馏水、去离子水、无水乙醇依次清洗各五次，60℃下真空干燥12h，得到Fe3O4磁 性纳米粒子。
[0019]进一步地，所述戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠的步骤如下：称取5mg氨基化磁珠溶解 于5mL 10mM磷酸盐缓冲液中超声20min；向体系中加入1.25mL 25％戊二醛，室温缓慢振荡 1h，在磁铁的作用下富集分离Fe3O4并用PBS清洗3次以去除物理性吸附的戊二醛；向Fe3O4磁性粒子加入500ul 1mg/mL的链霉亲和素，室温缓慢振荡6h；在磁铁作用下富集分离亲和 素化氨基磁铁，舍弃含有游离亲和素的上清，用PBS反复清洗；向亲和素化氨基磁珠中加入 5m L 10mg/m L的BSA室温缓慢振荡6h以封闭未反应的和非特异性结合位点，在磁铁作 用下富集分离磁性粒子并反复清洗，最终重悬于5mL 10mM的PBS中，置于4℃保存备 用。
[0020]进一步地，所述核酸适配体功能化的量子点的制备方法为：ZNS：Mn量子点加入60uLEDC和30uL NHS，避光振荡30min活化量子点表面的羧基基团，接着加入氨基化修饰的A4 适配体，量子点与适配体的摩尔比为1:10，振荡反应1h，加入乙醇胺继续反应2h，封闭量 子点表面未反应的羧基基团，得到核酸适配体功能化的量子点。
[0021]进一步地，所述食源性肠道致病菌O157:H7菌落总数与荧光强度之间的关系为： IF＝1.8286x+3.1916，R2＝0.9951，IF指荧光信号强度，x指检测用细菌的菌落总数对数值，线 性检测范围是13～1.3
×
106CFU/mL，检出限为13CFU/mL。
[0022]纳米磁颗粒，又称纳米磁珠，是一种新型的磁性纳米材料，它不仅具有粒径小、比表面 积大、偶联容量高等特点，而且还具有超顺磁作用，可以在外力磁场下聚集和固定，因此可 以将特定基团修饰的物质偶联在其表面，用于物质的分离和筛选。本专利技术将修饰有生物素的 适配体与纳米磁珠偶联，形成可以捕获靶细菌的复合物。利用生物素和链霉亲和素可以高特 异性结合的特点，首先我们将筛选出的靶细菌适配体进行生物素化修饰，然后选取链霉亲和 素包被的纳米磁珠，从而使适配体连接到磁珠表面。结合形成的磁珠
‑
适配体
上清液中即含有筛选得到的单链DNA寡核苷酸。
[0041](4)以得到的上清液为模板，优化聚合酶链反应条件，加入5μL PCR Buff本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，包括：以E.coli O157:H7为靶标，经过多轮筛选富集，获得特异性结合E.coli O157:H7的核酸适配体；对所构建的A5适配体进行生物素修饰，通过链酶亲和素和生物素之间的结合反应，获得核酸适配体功能化的纳米富集磁珠；对所构建的A4适配体进行量子点修饰，通过共价修饰制备得到核酸适配体功能化的量子点；取核酸适配体功能化的纳米富集磁珠作为捕获探针，捕获反应体系中存在靶细菌，进行孵育后通过磁分离器回收磁珠适配体
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靶细菌；然后向其中加入核酸适配体功能化的量子点，进行孵育结合；在磁场作用下富集磁珠，将沉淀重悬于缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧光强度，根据荧光强度确定食源性肠道致病菌O157：H7的菌落总数。2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述A5适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述A4适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述核酸适配体功能化的纳米富集磁珠的制备方法为：采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子；将Fe3O4磁性纳米粒子分散于乙醇水溶液中，超声混合，加入氨丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌并充入氮气保护，室温反应7～10h，然后用磁铁进行磁分离，清洗、干燥后得到氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子；基于戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠；在A5核酸适配体的5
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端进行生物素标记得到功能化的核酸适配体；将亲和素化氨基磁珠和功能化的核酸适配体混合，得到核酸适配体功能化的纳米富集磁珠。5.根据权利要求4所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子的步骤如下：将浓度为0.12mol/L FeSO4·
7H2O和浓度为0.2mol/L ...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋鲁岩，王毅谦，朱振华，曾德新，高渊，杨天宇，封振，徐振东，张娜，
申请(专利权)人：南京海关动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：